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1、葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記多為抗生素抗性基因,它們雖然高效,但存在不少缺點(diǎn)。四吡咯分子如血紅素、葉綠素和西羅血紅素是植物重要的功能分子,其合成一些關(guān)鍵酶的編碼基因,如編碼谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶的基因作為植物轉(zhuǎn)基因的安全標(biāo)記,根據(jù)轉(zhuǎn)基因后代的白化性狀,進(jìn)行高效篩選,而尿卟啉原甲基化酶是一種新型紅色熒光蛋白,但是,在植物中的應(yīng)用還沒(méi)有報(bào)道。目前,煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化的技術(shù)最為成熟,本研究主要構(gòu)建煙草葉綠體轉(zhuǎn)化載體,將大腸桿菌編碼谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶的基因he
2、mL作為篩選標(biāo)記,玉米編碼尿卟啉原甲基化酶的基因cobA作為熒光報(bào)告基因,利用同源重組片段trnI/trnA構(gòu)建煙草葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
1.采用改進(jìn)的高鹽低pH法提取煙草葉綠體基因組DNA,基因組大小為23kb,OD260:OD280值均在1.8~2.0范圍內(nèi),提取的葉綠體基因組質(zhì)量很高。
2.根據(jù)NCBI公布的煙草同源重組蛋白trnI/trnA、質(zhì)體核搪體(16S)RNA操縱元啟動(dòng)子
3、Prrn和質(zhì)體psbA基因3’端psbA3’序列,以煙草葉綠體基因組為模板,PCR擴(kuò)增出trnI/trnA、Prrn、psbA3’的特異DNA片段,擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果:trnI基因長(zhǎng)度為969 bp,trnA基因長(zhǎng)度為883 bp,Prrn基因長(zhǎng)度為144 bp,psbA3,基因長(zhǎng)度為508 bp,與煙草葉綠體基因組公布的序列進(jìn)行對(duì)比分析,同源性較高。
3.根據(jù)公布的hemL和cobA序列,分別以大腸桿菌谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶基因
4、GSAT的重組質(zhì)粒和玉米尿卟啉原甲基化酶SUMT的重組質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增出hemL和cobA特異片段。擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果:hemL基因長(zhǎng)度為1288bp,cobA基因長(zhǎng)度為846 bp。與公布的序列進(jìn)行對(duì)比分析,同源性為100%。
4.分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化相應(yīng)的重組質(zhì)粒,回收外源片段,根據(jù)pBluescript SK+多克隆位點(diǎn)和順序,按差異性位點(diǎn)將外源片斷依次插入到pBluescript SK+中,構(gòu)建了煙草新
5、型葉綠體表達(dá)載體pBSK-TPTCPhemL,序列為:trnI→Prrn→RBS→hemL→RBS→cobA→psbA3’→trnA。用HindⅢ酶切pBSK-TPTCPhemL載體,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小為7000 bp左右,說(shuō)明構(gòu)建的載體大小正確。
綜上所述,本文成功克隆了編碼煙草葉綠體表達(dá)載體的基因片段,并構(gòu)建了煙草表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因作為葉綠體轉(zhuǎn)化的篩選基因和標(biāo)記基因、建立安全高效的葉綠體轉(zhuǎn)化體系和生物
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