煙草葉綠體-核共轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化煙草初步研究.pdf

1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)有了成熟的方法和有效的轉(zhuǎn)基因植株篩選、再生措施。目前轉(zhuǎn)基因植物中普遍應(yīng)用的選擇標(biāo)記基因是編碼抗生素抗性的基因。選擇標(biāo)記基因是為方便鑒定和篩選而加入的，對于成功篩選轉(zhuǎn)基因植株起到了很有效的作用。但攜帶選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物對人體和環(huán)境卻存在潛在的危害，這也是轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用到生產(chǎn)上的阻礙因素之一；另外，標(biāo)記基因的存在會阻礙用同樣的標(biāo)記基因進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化選擇；去除標(biāo)記基因也可以減少目的基因沉默幾率。因此，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物

2、中選擇標(biāo)記基因特別是抗性標(biāo)記基因的控制的研究迅速開展起來，到今天為止已經(jīng)有了一系列應(yīng)對的生物安全策略，其中可以通過共轉(zhuǎn)化的的方法在得到轉(zhuǎn)基因植物后將標(biāo)記基因刪除，到目前為止，都是通過篩選基因與目的基因共轉(zhuǎn)化進(jìn)植物核基因組中，還沒有關(guān)于葉綠體一核基因組共轉(zhuǎn)化的報道。 本實(shí)驗(yàn)即立足于轉(zhuǎn)基因植物的生物安全控制方法模式韻建立，本文通過構(gòu)建葉綠體一核共轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化模式植物煙草，探討葉綠體一核共轉(zhuǎn)化模式用于篩選無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物的可能

3、性。 首先在質(zhì)粒pICF6061的框架上加入CaMV 35S Pro-mgfp4-NOS ter框，初步構(gòu)建了可用于煙草葉綠體-核基因組共轉(zhuǎn)化的載體pICF6061.G。再從百日紅煙草DNA中通過PCR的方法擴(kuò)增出一段煙草核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列，經(jīng)過序列測定和NCBI和DNAman比對，確定為煙草MAR序列Rb7,將Rb7順式連接入葉綠體轉(zhuǎn)化載體pICF6061．G的mgfp4框兩側(cè)，構(gòu)建了可用于煙草的葉綠體一核轉(zhuǎn)化載體pICF606

4、1.G.R。該載體含可在葉綠體基因組中表達(dá)的卡那霉素篩選標(biāo)記基因aphA-6,具有煙草葉綠體基因組16S啟動子；含有可在核基因組中表達(dá)的核標(biāo)記基因綠色熒光蛋白基因mgfp4, 具有煙草核基因組35S啟動子；在aphA-6和mgfp4框兩側(cè)具有兩段煙草葉綠體同源片段trnN和trnR,可使目的基因通過同源重組的方式定點(diǎn)整合到煙草葉綠體基因組中；MAR序列Rb7置于外源基因兩端可以減少外源基因在不同轉(zhuǎn)化體間表達(dá)水平的差異，提高pICF606

5、1.G.R中mgfp4的表達(dá)水平。 將構(gòu)建的葉綠體一核轉(zhuǎn)化載體pICF6061.G.R用基因槍的方法，通過金粉子彈轟擊煙草3月齡無菌苗葉片，轟擊后的葉片切成小塊后在MS再生培養(yǎng)基上經(jīng)過400mg/L卡那霉素篩選，葉片小塊先后長出愈傷，分化出不定芽、叢生芽,將小芽切下轉(zhuǎn)入無激素MS培養(yǎng)基上生根，其間保持抗生素篩選壓，RT-PCR表明基因aphA-6已經(jīng)整合進(jìn)葉綠體基因組中并已表達(dá)。用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)卡那霉素的再生煙草其綠色熒光蛋白