馬鈴薯無(wú)標(biāo)記抗病毒雙價(jià)表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化.pdf

1、馬鈴薯為我國(guó)北方重要栽培作物，其病毒性退化是生產(chǎn)中存在的主要問題。在諸多引起馬鈴薯退化的病毒當(dāng)中，卷葉病毒(PLRV)與紡錘塊莖類病毒(PSTVd)的危害不僅減產(chǎn)嚴(yán)重，而且發(fā)生十分普遍。有研究表明，蚜蟲在傳播PLRV的同時(shí)助長(zhǎng)PSTVd擴(kuò)散。因此，對(duì)于PLRV與PSTVd的共同防治顯得尤為重要。以轉(zhuǎn)基因方法培育抗病毒品種是一條經(jīng)濟(jì)有效的措施。目前已知利用正單鏈RNA病毒基因的RNA干擾型結(jié)構(gòu)可使轉(zhuǎn)基因植物獲得較高抗病性，而對(duì)類病毒最有效

2、的途徑是以核酶切割病毒核酸。
　　本試驗(yàn)根據(jù)GenBank已報(bào)道的PLRV基因組序列，在分析其基因間隔區(qū)（IS)及其兩端的保守序列基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)特異性引物，以PLRV內(nèi)蒙分離物總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到含PLRV IS的兩段369bp的cDNA(IS-ClaI-BstpI與IS-Kpn-Bgl(Ⅱ))。重組質(zhì)粒pBS-T-IS經(jīng)PCR鑒定、酶切分析和核苷酸序列測(cè)定，并進(jìn)一步與PLRV其它分離物的同源序列進(jìn)行了比

3、對(duì)與進(jìn)化樹分析。其結(jié)果顯示，所克隆的PLRV內(nèi)蒙分離物的IS序列在PLRV不同株系和分離物之間的同源性很高，最高達(dá)到100％，平均為97.90％;同時(shí)IS在PLRV全基因組序列中也是相對(duì)保守的，且PLRV基因間隔區(qū)中存在高度保守的UUAUAUU序列。這表明基因間隔區(qū)對(duì)于植物病毒的增殖具有普遍的重要作用。
　　同時(shí)根據(jù)錘頭型核酶的作用模式，設(shè)計(jì)、合成并克隆了特異切割馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)負(fù)鏈RNA不同區(qū)域位點(diǎn)的雙價(jià)錘頭

4、型核酶基因(DR)。PCR檢測(cè)、酶切分析和核苷酸序列測(cè)定結(jié)果說明該核酶合成正確。
　　通過中間表達(dá)載體pSKN-DR、pSKN-35S-DR、p3301-DR、pKAN-IS，最終構(gòu)建了無(wú)選擇標(biāo)記的PLRV IS反向重復(fù)序列與特異切割PSTVd核酶雙價(jià)表達(dá)載體p3301-DR-Isir。構(gòu)建過程中，分別對(duì)每個(gè)重組載體進(jìn)行了PCR和限制性內(nèi)切酶檢測(cè)。核苷酸測(cè)序結(jié)果表明表達(dá)載體p3301-DR-Isir構(gòu)建成功。
　　采用凍融法

5、將表達(dá)載體p3301-DR-Isir導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化東北白和晉薯7號(hào)馬鈴薯品種，對(duì)轉(zhuǎn)化過程中外植體選擇、農(nóng)桿菌侵染濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響作了初步研究，明確了根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化的適宜條件為:外植體預(yù)培養(yǎng)2d，農(nóng)桿菌OD600為0.3-0.5，侵染外植體10min，共培養(yǎng)4d。供試品種的莖段和葉片均可做外植體使用。
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了無(wú)選擇標(biāo)記的PLRV IS反向重復(fù)序列與