HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機(jī)突變組合文庫的構(gòu)建及親和篩選.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)歸屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中慢病毒屬，主要經(jīng)血液、性接觸及母嬰垂直途徑等傳播，可引起獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)，即艾滋病。目前，艾滋病感染已經(jīng)成為全球所面臨的重大公共衛(wèi)生問題。研制有效的HIV疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索HIV疫苗研究的新策略和尋找新的疫苗靶點(diǎn)對(duì)疫苗的成功

2、研發(fā)顯得尤為重要。
　　 HIV-1反式激活蛋白(Trans-activator oftranscription，Tat)是HIV感染早期產(chǎn)生的一種重要調(diào)控蛋白，在HIV-1的復(fù)制、擴(kuò)散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶細(xì)胞后，胞質(zhì)中合成的Tat轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體(transcription initiation complex，TIC)，促進(jìn)病毒RNA的轉(zhuǎn)錄、延伸和病毒復(fù)制[1]。此外，Ta

3、t還可被感染細(xì)胞通過多種方式分泌到胞外發(fā)揮“病毒毒素”的作用：①通過誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞或B細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮其免疫抑制的作用[2，3，4，5，6]；②通過JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)激活HHV-8的復(fù)制，或通過RGD(Arg-Gly-Asp)與內(nèi)皮細(xì)胞αvβ3和α5β1整合素結(jié)合，與可溶性炎癥因子和血管生成因子協(xié)同促進(jìn)卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)的形成[7，8]；③通過影響神經(jīng)細(xì)胞鈣流，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和小膠

4、質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TGF-β、TNF等神經(jīng)毒性物質(zhì)，發(fā)揮神經(jīng)毒作用，促進(jìn)艾滋病腦病的發(fā)生[9,10,11]。
　　 Tat堿性氨基酸富集區(qū)(49-57aa)是Tat的穿膜和核定位功能基序，是Tat蛋白的主要中和表位之一。其中和抗體可消除Tat分子所特有的穿入其他細(xì)胞發(fā)揮毒性的核心功能[12]。此外，Tat堿性區(qū)序列在各亞型間高度保守，有利于產(chǎn)生交叉反應(yīng)譜更廣的抗體。已有研究表明，構(gòu)建Tat51位、55位定點(diǎn)突變后，堿性區(qū)表位未被破壞，且

5、Tat穿膜活性和胞外活性被大大減弱[13]。因此本研究擬利用噬菌體展示技術(shù)分子進(jìn)化平臺(tái)，對(duì)天然Tat堿性區(qū)進(jìn)行重組改造和篩選，為保證Tat堿性區(qū)表位的完整性，我們保留了Tat核心區(qū)(38-48aa)，構(gòu)建由核心堿性區(qū)突變片段經(jīng)隨機(jī)連接肽相互連接的重復(fù)串聯(lián)的噬菌體展示文庫，用含有高中和活性Tat抗體的兔抗血清進(jìn)行親和篩選，以期獲得一系列堿性區(qū)表位構(gòu)象穩(wěn)定，而生物活性明顯降低的突變體序列，為新型Tat疫苗的研發(fā)做基礎(chǔ)研究。
　　 本

6、研究分以下三部分進(jìn)行：
　　 一、HIV-1 PET32a-Tat38-61蛋白的表達(dá)及免疫反應(yīng)性鑒定
　　 功能研究表明：Tat蛋白核心區(qū)(38-48aa)可與旁觀未感染細(xì)胞的微管蛋白結(jié)合引發(fā)細(xì)胞凋亡[14]；Tat蛋白堿性區(qū)(49-57aa)介導(dǎo)Tat蛋白穿膜，與Tat細(xì)胞外活性密切相關(guān)[14,15]。結(jié)構(gòu)研究表明[16]：Tat分子為天然非折疊蛋白，屬于無規(guī)則卷曲類型的分子，缺乏穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，其分子構(gòu)想

7、極不穩(wěn)定，出于快速動(dòng)態(tài)的變化之中，導(dǎo)致以Tat作為抗原，刺激效果差，高親和力的抗體較少且容易被降解。因此，Tat核心堿性區(qū)重要表位是否能夠得到保留是噬菌體突變文庫親和篩選的基礎(chǔ)。為此，我們首先將Tat的核心堿性區(qū)38-61aa構(gòu)建到原核表達(dá)載體，純化出PET32a-Tat38-61蛋白，并通過含有Tat抗體的陽性血清對(duì)其進(jìn)行免疫反應(yīng)性鑒定。
　　 我們成功構(gòu)建并表達(dá)出PET32a-Tat38-61蛋白，并通過ELISA鑒定其免疫

8、反應(yīng)性，結(jié)果顯示含Tat抗體的血清與PET32a-Tat3861融合蛋白呈特異性反應(yīng)，說明PET32a-Tat38-61蛋白堿性區(qū)重要表位得到保留，為進(jìn)一步制備針對(duì)核心堿性區(qū)的中和抗體以及隨機(jī)突變文庫的親和篩選奠定基礎(chǔ)。
　　 二、HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機(jī)突變組合文庫的構(gòu)建
　　 研究表明，堿性區(qū)兩個(gè)重要的位點(diǎn)51K和55R定點(diǎn)突變后，對(duì)該表位無破壞，且Tat穿膜活性和胞外活性被大大減弱。因此，為了獲得一系列堿性

9、區(qū)表位構(gòu)象穩(wěn)定，而生物活性明顯降低的突變體，我們首先構(gòu)建了針對(duì)Tat堿性區(qū)的突變體文庫。通過采用含隨機(jī)核苷酸序列的引物， Overlap PCR方法對(duì)堿性區(qū)兩個(gè)位點(diǎn)51K和55R進(jìn)行了隨機(jī)突變，使之轉(zhuǎn)變成51X和551X。此外，構(gòu)建適合的大容量生物大分子變異體文庫是進(jìn)行體外分子進(jìn)化研究的關(guān)鍵。因此，為了擴(kuò)大堿性區(qū)基因序列中被篩選的范圍，同時(shí)在堿性區(qū)61位后引入6個(gè)隨機(jī)連接肽X6，以期擴(kuò)大文庫的重組子，并利用隨機(jī)連接肽可與堿性區(qū)表位序列之

10、間相互作用，穩(wěn)定展示表位的構(gòu)象。
　　 我們成功構(gòu)建了HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機(jī)突變組合文庫，并且其庫容、多樣性、隨機(jī)性均達(dá)到文庫構(gòu)建要求，為后續(xù)用含有高中和活性的抗Tat兔抗血清進(jìn)行親和篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 三、HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機(jī)突變組合文庫的親和篩選
　　 通過第一部分的鑒定，我們發(fā)現(xiàn)堿性區(qū)肽段可以較好的保留其中和表位，我們用兩種兔抗血清：兔抗PET32a-Tat1-101和兔抗PET3

11、2a-Tat38-101，同時(shí)對(duì)TCBR隨機(jī)突變組合文庫進(jìn)行親和篩選，以期獲得親和力更強(qiáng)，穿膜活性更低新型免疫原的代表性序列。通過兩種兔抗血清同時(shí)對(duì)文庫進(jìn)行兩輪篩選，每輪結(jié)束后，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)PCR鑒定過的陽性克隆進(jìn)行序列分析。
　　 兩種Tat兔抗血清對(duì)TCBR文庫兩輪篩選后重組子PCR鑒定結(jié)果顯示：①TCBR文庫中突變片段的插入率由70％上升到90％左右，說明與Tat抗體親和高的突變體片段通過篩選得到有效富集

12、；②包含2個(gè)突變片段的重組子在文庫中所占的比例顯著下降，而包含單個(gè)突變片段的重組子在文庫中所占的比例由篩選前的55％上升到90％左右。理論上，通過連接肽串聯(lián)重復(fù)多個(gè)突變體片段形成的大分子多肽，由于親和力的關(guān)系，抗原表位重復(fù)次數(shù)多具有選擇性優(yōu)勢(shì)，容易被進(jìn)化篩選獲得。但兩輪篩選后突變體片段結(jié)構(gòu)的變化，似乎說明突變體片段的重要突變位點(diǎn)51位、55位的突變情況較大分子多肽對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原表位的富集具有更重要的作用。
　　 兩種Tat兔抗血清對(duì)

13、TCBR文庫每輪篩選后，對(duì)40個(gè)重組子進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示：①51位堿性氨基酸得到富集，這與理論相符，天然Tat51位為賴氨酸(K)；②51位、55位都出現(xiàn)特征性氨基酸脯氨酸(P)。一項(xiàng)日本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果似乎說明51位突變成P更有利于Tat穿膜[18]，這與本實(shí)驗(yàn)的目的截然相反，但出現(xiàn)了相同的特征性氨基酸，這種聯(lián)系還需要進(jìn)一步的研究。似乎脯氨酸本身結(jié)構(gòu)更容易穩(wěn)定表位的空間構(gòu)象。③51S-55P可作為一個(gè)有意義的候選特征序列，進(jìn)一步研究。

14、另有一項(xiàng)法國(guó)實(shí)驗(yàn)研究表明，將Tat堿性區(qū)的51位賴氨酸(K)定點(diǎn)突變成蘇氨酸(T)，55位精氨酸(R)定點(diǎn)突變成亮氨酸(L)，構(gòu)成突變體“STLA Tat”，其反式激活活性消除，胞外毒性大大降低。根據(jù)氨基酸分類，51位T為極性氨基酸，而篩選得到的特征性氨基酸S與也同為極性氨基酸，55位L為疏水性氨基酸，而篩選得到的特征性氨基酸P與也同為疏水性氨基酸，因此，根據(jù)篩選所得特征性氨基酸結(jié)合已有研究，可將51S-55P作為一個(gè)有意義的候選特征序

15、列，做進(jìn)一步研究。帽綜上所述，我們成功用兩種兔抗血清對(duì)TCBR隨機(jī)突變文庫進(jìn)行了兩輪親和篩選，并通過對(duì)候選重組子序列測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)突變片段的重要位點(diǎn)51位、55位的出現(xiàn)特征性氨基酸，51X為P\S，55X為Y/P，其中，51S-55P可作為一個(gè)有意義的可選候選特征序列，進(jìn)一步研究。
　　 本課題構(gòu)建了pET32a-tat38-61原核表達(dá)質(zhì)粒，純化并鑒定了PET32a-Tat38-61蛋白的免疫反應(yīng)性，為后續(xù)使用Tat兔抗血清對(duì)

16、堿性區(qū)突變體文庫篩選奠定了基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了HIV-1 Tat核心堿性區(qū)隨機(jī)(TCBR)突變組合文庫并通過兩種抗Tat兔抗血清PET32a-Tat1-101和PET32a-Tat38-101對(duì)文庫進(jìn)行了兩輪篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選后重組子突變片段的重要位點(diǎn)51位、55位的出現(xiàn)特征性氨基酸，51X為P\S，55X為Y/P，其中，51S-55P可作為一個(gè)有意義的候選特征序列，進(jìn)一步研究。本研究嘗試應(yīng)用以噬菌體展示技術(shù)為基礎(chǔ)的分子進(jìn)化手段對(duì)HIV-1