HIV-1 Tat分子的改造、原核表達(dá)、純化和免疫學(xué)分析.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)即艾滋病病毒感染是目前嚴(yán)重威脅人類健康和社會(huì)穩(wěn)定的嚴(yán)重傳染病之一。為降低感染者的發(fā)病率以避免更多的人感染HIV病毒，研制有效的HIV疫苗成為HIV防治的重要手段之一。 HIV分為1型和2型，其中HIV-1目前流行最為廣泛。HIV-1Tat(trans-activator of transcription)蛋白是病毒產(chǎn)生的重要調(diào)控蛋白和致病因子，在

2、HIV-1的復(fù)制、擴(kuò)散和致病中起重要作用。HIV-l感染靶細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)中合成的Tat可進(jìn)入細(xì)胞核，與HIV-1新生RNA的反式激活效應(yīng)元件(transactivating responsive region，TAR)結(jié)合促進(jìn)其延長，反式激活HIV-1RNA的轉(zhuǎn)錄，從而激活HIV-1的增殖。此外，Tat還可被感染細(xì)胞分泌到胞外發(fā)揮多種細(xì)胞外作用并在致病中起重要作用。因此，阻斷Tat分子對病毒復(fù)制的影響以及細(xì)胞外毒性作用，是制備預(yù)防性和治

3、療性的Tat疫苗的主要依據(jù)。 原核表達(dá)制備的Tat蛋白具有相對穩(wěn)定的空間構(gòu)象，所誘導(dǎo)的抗體具有較高的抗體滴度和較好的中和活性，但是其表達(dá)量較低，限制了Tat蛋白的大規(guī)模制備。化學(xué)合成制備的蛋白具有純度高、產(chǎn)量大的優(yōu)勢，但該方法制備的Tat蛋白構(gòu)象不夠穩(wěn)定，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度低，中和活性也較差。因此，提高Tat蛋白的原核表達(dá)量、穩(wěn)定性和免疫原性對于Tat疫苗的制備具有重要意義。 本研究分以下四部分進(jìn)行： 一.HI

4、V-1型HXB2株Tat(1-101aa)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和免疫原性分析 根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子優(yōu)化后的HIV-1型HXB2株Tat DNA序列設(shè)計(jì)引物，用重疊延伸PCR方法合成HIV-1 Tat DNA編碼序列，用T/A克隆法將其插入pMD-18T載體進(jìn)行測序。將TatDNA克隆至原核表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Tat(1-1O1aa)，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

5、出相對分子量為31000的融合蛋白，并用Ni-NTA親和層析法純化表達(dá)蛋白，純化后目的蛋白濃度為1.50mg/ml。PET32a-Tat(1-101aa)蛋白免疫家兔，ELISA方法對抗血清進(jìn)行免疫學(xué)分析，結(jié)果表明可產(chǎn)生效價(jià)為1:640000的抗體且特異性針對Tat(1-101aa)蛋白。 二.HIv-1型HXB2株Tat蛋白在大腸桿菌中的分段表達(dá)、純化和免疫原性分析 原核表達(dá)的Tat蛋白濃度偏低，為了尋找對表達(dá)產(chǎn)生影響

6、的原因和其重要的抗原表位，根據(jù)所包含功能區(qū)的不同，將Tat蛋白劃分為三個(gè)區(qū)域(1-48位氨基酸，22-72位氨基酸，38-101位氨基酸)分段進(jìn)行原核表達(dá)。用PCR方法獲得Tat(1-48aa)，Tat(22-72aa)和Tat(38-101aa)DNA片段，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Tat(1-48aa)，pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa)，并轉(zhuǎn)入E coli BL21(DE3)中，

7、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出相對分子量分別為23000、23000和25000的融合蛋白，Ni-NTA親和層析法純化后其濃度分別為4.26mg/ml、3.35mg/ml和5.11mg/ml。ELISA法檢測三種目的蛋白PET32a-Tat(1-48aa)，PET32a-Tat(22-72aa)和PET32a-Tat(38-lOlaa)與兔抗PET32a-Tat(1-1O1aa)抗血清均呈特異性結(jié)合，其抗體滴度分別為1:128000、1:32000

8、、1:64000，而與PET32a蛋白僅有較弱結(jié)合。說明半胱氨酸富集區(qū)(22-37位氨基酸)對Tat蛋白的原核表達(dá)有較顯著影響；Tat蛋白的N端區(qū)、堿性區(qū)和C端區(qū)是其重要的抗原表位，其中N端區(qū)的免疫原性最強(qiáng)。 三.缺失半胱氨酸富集區(qū)的HIV-1型HXB2株Tat蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)、純化和免疫原性分析 為提高Tat蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量和分子穩(wěn)定性以及開發(fā)HIV Tat疫苗的新型免疫原，用PCR方法對Tat蛋白的

9、半胱氨酸富集區(qū)(22-37位氨基酸)進(jìn)行缺失突變，獲得Tat(△C)DNA序列，克隆至pMDl8-T載體中進(jìn)行測序鑒定。鑒定正確的序列克隆構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Tat(△C)。pET32a-Tat(AC)質(zhì)粒和pET32a-Tat(1-101aa)質(zhì)粒相同條件下轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中分別誘導(dǎo)表達(dá)出相對分子質(zhì)量為29000的和31000的融合蛋白，Ni-NTA親和層析法純化后目的蛋白濃度分別為7.12mg/ml和1

10、.50mg/ml，缺失半胱氨酸富集區(qū)后Tat蛋白原核表達(dá)量明顯提高。 原核表達(dá)后立即純化的PET32a-Tat(1-101aa)蛋白就有二聚體的形成，而PET32a-Tat(Δc)蛋白則無二聚體形成。進(jìn)一步將PET32a-Tat(1-101aa)和PET32a-Tat(Δc)蛋白分別置于25℃和4℃存放7天后，PET32a-Tat(1-101aa)蛋白出現(xiàn)了明顯的二聚體，而PET32a-Tat(AC)蛋白則無二聚體的形成，說明缺

11、失半胱氨酸富集區(qū)后Tat蛋白穩(wěn)定性得到提高。 用PET32a-Tat(Δc)融合蛋白免疫家兔制備抗血清，ELISA和Western-blot方法對抗血清進(jìn)行免疫學(xué)分析。PET32a-Tat(ΔC)蛋白免疫家兔可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體(1:320000)，該抗體與Tat(Δc)蛋白、Tat(1-101aa)蛋白及化學(xué)合成Tat(1-86aa)蛋白均呈特異性和交叉性反應(yīng)。 四.不同Tat抗原檢測HIv-1型感染者血清抗體的比較

12、 用原核表達(dá)的PET32a-Tat(1-101aa)蛋白、PET32a-Tat(Δc)蛋白和化學(xué)合成Tat(1-86aa)蛋白檢測與HIV-1型感染者血清的結(jié)合反應(yīng)，分析比較其檢測的陽性率和結(jié)合反應(yīng)的特異性，篩選出最佳抗原用于臨床檢測。 PET32a-Tat(Δc)抗原檢測HIV-1感染者血清陽性率達(dá)到13.5％，明顯高于同時(shí)比較的另外兩種抗原；ELISA反應(yīng)中PET32a-Tat(ΔC)抗原與HIV-1感染者血清結(jié)合反

13、應(yīng)陽性的A450平均值為0.193，高于同時(shí)比較的另外兩種抗原;PET32a-Tat(ΔC)抗原與HIV-1感染者血清結(jié)合反應(yīng)陰性的A450平均值為0.024，低于同為原核表達(dá)的PET32a-Tat(1-101aa)抗原。說明PET32a-Tat(Δc)蛋白與JIV-l感染者血清結(jié)合反應(yīng)性最強(qiáng)且缺失半胱氨酸富集區(qū)后降低了其與HIV-1感染者血清中Tat抗體的非特異性結(jié)合。 本研究尋找出對Tat蛋白原核表達(dá)有影響的區(qū)域--半胱氨酸

14、富集區(qū)，并成功構(gòu)建了缺失半胱氨酸富集區(qū)的Tat蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Tat(ΔC)。缺失半胱氨酸富集區(qū)后，Tat蛋白的原核表達(dá)水平和穩(wěn)定性都獲得明顯提高，保留了其免疫原性并獲得一定的交叉反應(yīng)性。PET32a-Tat(△C)抗原與HIV-1感染者血清結(jié)合反應(yīng)性最強(qiáng)且缺失半胱氨酸富集區(qū)后降低了其與HIV-l感染者血清中Tat抗體的非特異性結(jié)合。這不僅為開發(fā)新一代的HIV Tat疫苗提供了可能的新型免疫原，也為Tat蛋白的結(jié)構(gòu)和功能