水稻miR393a-OsTIR1模塊在種子萌發(fā)時(shí)胚芽鞘和胚根中的時(shí)空表達(dá)模式及其功能研究.pdf

1、miRNA393是植物中一個(gè)保守的microRNA家族，其功能研究主要包括植物免疫反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫反應(yīng)三個(gè)方面。迄今，miR393/靶基因表達(dá)在種子萌發(fā)中的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能尚無(wú)報(bào)道。水稻是重要的禾本科作物，具有能在水淹條件下種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的獨(dú)特生長(zhǎng)習(xí)性。其中空結(jié)構(gòu)的胚芽鞘通過(guò)不斷伸長(zhǎng)至氧氣充足的水面，以獲得種子萌發(fā)所需的氧氣，為水稻提供了一個(gè)水淹環(huán)境下的生存機(jī)制。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水稻miR393的靶基因是生長(zhǎng)素受體基因OsT1R

2、1和OsAFB2，且miR393a在胚芽鞘中強(qiáng)表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)行miR393a/靶基因在水淹條件下種子萌發(fā)中的表達(dá)與功能研究。本文以水稻為研究材料，構(gòu)建了一系列miR393及其靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，希望通過(guò)對(duì)其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)、表型及調(diào)控機(jī)制的研究，探索miR393a/OsT1R1在水稻種子萌發(fā)時(shí)胚芽鞘和胚根生長(zhǎng)中的作用。獲得主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　一、在轉(zhuǎn)錄活性上的特征
　　(1) OsTIR1與OsAFB2的轉(zhuǎn)錄活性

3、部位不同。OsTIR1轉(zhuǎn)錄活性主要在主根、不定根和冠根的根尖，以及幼嫩的穎殼、葉舌和節(jié)中。而OsAFB2則主要在幼嫩的穎殼、葉節(jié)及節(jié)的部位。
　　(2)在種子萌發(fā)初期，MIR393a和Os TIR1的轉(zhuǎn)錄在不同組織（盾片，胚根，胚芽鞘，側(cè)根）呈現(xiàn)重疊、互補(bǔ)、相鄰的三種空間對(duì)應(yīng)特點(diǎn)。
　　(3)水稻胚芽鞘氣孔由一對(duì)腎形的保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成，不同于葉片氣孔中典型的啞鈴型保衛(wèi)細(xì)胞。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)MIR393a在氣孔形成早期的擬分生組織（

4、meristemoid）中強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄，暗示miR393可能參與了氣孔發(fā)育的調(diào)控。指示生長(zhǎng)素反應(yīng)的DR5啟動(dòng)子元件在氣孔發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中都有轉(zhuǎn)錄活性，在成熟的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中最強(qiáng)。
　　二、對(duì)水稻萌發(fā)階段生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)基因的影響
　　(1) miR393表達(dá)促進(jìn)水稻萌發(fā)初期胚根的生長(zhǎng)，并抑制側(cè)根的生長(zhǎng)。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，MIR393過(guò)表達(dá)株系的胚根伸長(zhǎng)區(qū)的長(zhǎng)度增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目增多，而MIM393株系伸長(zhǎng)區(qū)變短，細(xì)胞數(shù)減少。
　　(

5、2)過(guò)量表達(dá)miR393抑制胚芽鞘和胚芽鞘頂端氣孔的生長(zhǎng)，并使胚芽鞘中的細(xì)胞壁松弛因子(Expansin)基因EXPA4，EXPA7和EXPB12基因的轉(zhuǎn)錄水平下降。
　　(3)經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法對(duì)游離生長(zhǎng)素含量的測(cè)定結(jié)果顯示，miR393促進(jìn)胚芽鞘中游離生長(zhǎng)素的積累。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR393可以提高胚芽鞘中生長(zhǎng)素合成關(guān)鍵基因Os YUCCA1和Os YUCCA4的轉(zhuǎn)錄水平。
　　三、在

6、水淹條件和ABA處理中的調(diào)控機(jī)制
　　(1)水淹(submergence)減弱了MIR393口在胚芽鞘尖端和其上氣孔中的轉(zhuǎn)錄活性，并增強(qiáng)了其中的DR5反應(yīng)。
　　(2) ABA處理抑制胚芽鞘生長(zhǎng)，增強(qiáng)了MIR393a在胚芽鞘尖端和氣孔中的轉(zhuǎn)錄活性，并減弱了其中的DR5反應(yīng)。ABA對(duì)水稻胚芽鞘生長(zhǎng)的抑制作用，很可能與EXPA2和EXPA4有關(guān)。
　　(3) Northern blot結(jié)果顯示，OsTIR1可以正向反饋調(diào)節(jié)