水稻miR393基因家族的表達模式及其對植株生長發(fā)育的影響.pdf

1、植物microRNA-靶基因相互作用參與生長素信號途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，影響植株各個階段的形態(tài)構(gòu)成和生長發(fā)育。miR393的靶基因為TIR1生長素受體基因家族，直接調(diào)控對生長素的感受。迄今，單子葉植物生長素受體TIR1的功能研究尚未報道。本文以單子葉模式生物水稻為研究材料，揭示miR393基因家族成員的表達模式以及miR393/靶基因TIR1表達改變對水稻植株生長發(fā)育的影響，并且運用RNAi技術(shù)對預(yù)測的靶基因進行功能鑒定，進而分析miR393

2、表達改變的株系對外源生長素處理的反應(yīng)。本研究主要結(jié)果如下：
　　 1．水稻miR393基因家族的表達模式：a）提取水稻不同時期不同組織的總RNA；b)根據(jù)miR393a和miR393b的前體序列，分別設(shè)計引物，利用Real timeRT-PCR法測定pre-miRNA的積累水平；c）根據(jù)miR393的成熟體設(shè)計特異探針，Northem blot檢測成熟miR393在不同組織中的積累情況。結(jié)果顯示，miR393a主要在地下部分的不

3、定根中表達，而miR393b主要在地上部分的莖尖分生組織、旗葉和幼穗中表達。說明水稻miR393基因家族成員具有不同的表達模式。
　　 2．水稻miR393基因家族的啟動子活性分析：克隆水稻miR393a和miR393b莖環(huán)序列上游2-2.5kb的片段，構(gòu)建連接GUS報告基因的啟動子分析載體：pmiR393a:GUS和pmiR393b::GUS，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻。對這些轉(zhuǎn)基因株系的GUS染色結(jié)果表明，miR393a主要

4、在不定根和側(cè)根原基、莖尖分生組織和花藥中表達，而miR393b只在莖尖分生組織中表達。該結(jié)果表明，水稻miR393a和miR393b基因在水稻植株中的轉(zhuǎn)錄活性存在明顯的組織特異性。
　　 3．過量表達miR393對水稻植株發(fā)育的影響：a）克隆水稻內(nèi)源miR393基因家族的兩個成員miR393a和miR393b，構(gòu)建過表達載體35S::miR393a和35S::miR393b，并轉(zhuǎn)化水稻；b）篩選出miR393a和miR393b的

5、單拷貝過量表達株系。對過表達miR393a和miR393b的T3代轉(zhuǎn)基因株系的表型進行觀察和分析，結(jié)果顯示過表達miR393嚴(yán)重干擾水稻的生長和發(fā)育，主要表現(xiàn)在植株矮小，旗葉下坡，分蘗增加，穎殼開裂，主根增長以及不定根數(shù)減少。
　　 4．通過模擬靶基因來抑制miR393作用的MIM393轉(zhuǎn)基因株系的獲得：設(shè)計引物克隆擬南芥IPS1基因及在IPS1的互補序列用來模擬miR393的靶位點(MIM393)，構(gòu)建抑制miR393作用的過

6、表達載體35S:MIM393，并轉(zhuǎn)化水稻。通過半定量以及定量RT-PCR鑒定，篩選出4株高表達MIM393株系。
　　 5．水稻miR393的靶基因的鑒定：采用生物信息學(xué)的方法尋找miR393的靶基因，初步推測水稻miR393的兩個靶基因Os04932460.1和Os05905800.1，根據(jù)序列聚類分析分別命名為OsAFB2和OsTIRI。通過定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)OsAFB2和OsTIRJ在過表達miR393轉(zhuǎn)基因株系中

7、的表達顯著下調(diào)，而且OsTIRJ在35S:MIM393轉(zhuǎn)基因株系旗葉中的表達顯著上調(diào)。說明miR393在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控OsAFB2和OsTIR1的表達。
　　 6．通過RNAi抑制OsAFB2和OsTIR1基因表達的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得：構(gòu)建p35S:RNAi-OsAFB2、p35S:：RNAi-OsTIR1和p35S:：RNAi-OsAFB2-OsTIR1載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，分別得到22株、18株和13株再生植株，進

8、一步驗證OsAFB2和OsTIR1基因表達抑制對水稻植株發(fā)育的影響。
　　 7．過量表達miR393增加對生長素反應(yīng)的抗性：a）在添加2.5mg/l2，4-D的N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)三周后，野生型種子誘導(dǎo)出愈傷組織，而35S::miR393a和35S::miR393b轉(zhuǎn)基因株系的種子仍未能誘導(dǎo)愈傷組織，表明miR393的過表達增強對外源生長素的抗性：b）對水稻幼苗的2，4-D處理實驗顯示，miR393b的表達顯著上調(diào)，而miR393a