C肽對高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究.pdf

1、背景和目的 糖尿病(diabetes mellitus，DM)作為一種代謝性疾病，其各種急、慢性并發(fā)癥是使患者致死、致殘的主要原因。慢性并發(fā)癥包括大中血管病變和微血管病變。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病微血管病變之一，是1型糖尿病的主要死因，亦是2型糖尿病的重要死因。DN的發(fā)病機(jī)制尚未明確，其早期表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞增生，小管間質(zhì)擴(kuò)張，腎小球系膜區(qū)和小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)積聚，伴隨出現(xiàn)蛋白尿及腎

2、小球?yàn)V過率降低，最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。近來的研究表明，高糖狀態(tài)對腎小球細(xì)胞是一種亞壞死性損傷劑，導(dǎo)致凋亡發(fā)生率增加，提示細(xì)胞凋亡可能參與了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。目前DN尚無特異性治療手段。因此，探索其發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效的防治措施已成為當(dāng)前重要的研究課題。 系膜細(xì)胞(mesangial cells，MCs)是腎小球內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要固有細(xì)胞，在DN

3、發(fā)病過程中不僅是被動受害者，而且也是直接參與者，通過其自身代謝和功能改變直接影響DN進(jìn)程。 C肽是胰島素A鏈和B鏈之間的連接肽。在研究胰島素的結(jié)構(gòu)和生物功能的關(guān)系中，過去人們一直認(rèn)為C肽無生物活性，僅在胰島素二硫鍵正確配對時(shí)起作用。但近年很多研究肯定C肽具有多種生物學(xué)作用。動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示，l型DM患者聯(lián)合補(bǔ)充胰島素和C肽后，可以減輕和延緩DM微血管并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展，這些療效是單獨(dú)應(yīng)用胰島素所不能完全達(dá)到的。提示C肽在糖尿

4、病防治中可能具有深遠(yuǎn)的意義。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY-1，觀察C肽和/或胰島素對細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，并進(jìn)行相關(guān)分析。進(jìn)一步證實(shí)c肽的生物活性及其對糖尿病的微血管保護(hù)作用，為臨床c肽與胰島素聯(lián)合應(yīng)用治療糖尿病提供更多的理論支持。 材料與方法 本實(shí)驗(yàn)在大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY-1體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。(1)葡萄糖組，分為正常對照

5、組(NG 5.5mmol/L)，高糖組(HG 33．3mmol/L)，高滲甘露醇組(mannitol 30mmol/L)；(2)C肽組(HG+C-p)；(3)胰島素組(HG+Ins)；(4)胰島素+C肽組(HG+Ins+C-p)。每組設(shè)平行孔6孔，培養(yǎng)24h、48h、72h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT)、原位末端標(biāo)記(TUNEL)法、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(SP法)檢測不同濃度的葡萄糖，C肽和胰島素對細(xì)

6、胞增殖、細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 (1) 高糖組在24h、48h、72h時(shí)段的吸光度值均較正常對照組增高，尤以48h增高最明顯，在72hH寸呈下降趨勢(P值均<0.05)；高滲甘露醇組與正常對照組相比差異無顯著性(P值>0.01)；C肽組與高糖組比較，當(dāng)C肽濃度為0.5nmool/L時(shí)，吸光度值無顯著差異(P值>0.05)；當(dāng)C肽濃度等于或大于10nmol/L時(shí)，吸光度值顯著下降(P值均<0.0

7、5)，系膜細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。 (2) 與正常對照組比較，其它實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞顯著增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；與高糖組比較，干預(yù)組均可使高糖誘導(dǎo)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)減少；且C肽和胰島素聯(lián)合組較單獨(dú)胰島素和單獨(dú)C肽干預(yù)陽性細(xì)胞數(shù)減少更明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雅均<0.05)。 (3) 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，高糖組較其它實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著增高(P值均<0.05)，而C肽和胰島素聯(lián)合組較高糖組明顯

8、降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05)。與正常對照組比較，高糖組凋亡率顯著增高(P值<0.05)；C肽和胰島素聯(lián)合組與高糖組比較，凋亡率降低，有顯著差異(P值<0.05)。 (4)bcl-2與bax基因在各組均有不同程度表達(dá)，與正常對照組比較，高糖組Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P值均<0.05)；與高糖組比較，C肽和胰島素聯(lián)合組Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，BaX蛋白表達(dá)減弱(P值均<0.05)。 結(jié)論

9、 (1)高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的細(xì)胞系HBZY-1存在增殖，C肽和胰島素能夠抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的異常增殖； (2)高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡增加，bax基因表達(dá)增加、bcl-2基因表達(dá)下降、bax/bcl-2比例上調(diào)，提示細(xì)胞凋亡及bcl-2、bax可能參與了糖尿病腎病的發(fā)??； (3)C肽和胰島素合用使Bax蛋白表達(dá)下降、Bcl-2蛋白表達(dá)增加，C肽通過影響bcl-2/bax基因表達(dá)減少大鼠腎小球系膜細(xì)