虹鱒、花鱸和大黃魚Δ6脂肪酸去飽和酶調控差異的研究.pdf

1、以虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、花鱸（Lateolabrax japonicus）和大黃魚（Larimichthys cr ocea）分別代表淡水、廣鹽性和海水肉食性魚類，研究三種不同適鹽性類型的肉食性魚受植物油影響的差異，以及體內△6脂肪酸去飽和酶調控差異。
　　本文主要研究內容和結果如下:
　　1.飼料中植物油替代魚油對虹鱒、花鱸和大黃魚幼魚生長、脂肪酸組成、脂肪沉積和組織結構的影響
　　以初始體

2、重分別為（11.24±0.07 g）、（18.60±0.36 g）和（8.93±0.21 g）的虹鱒、花鱸和大黃魚幼魚為研究對象，通過70d的攝食生長實驗，研究植物油（亞麻籽油∶豆油=1∶1）分別替代0％（FO，對照組）、50％(FV)和100％(VO)的魚油對不同適鹽性魚類生長性能、脂肪酸組成、脂肪沉積和組織結構的影響。
　　實驗結果表明，植物油替代50％和100％的魚油后不影響虹鱒的攝食、生長、飼料效率和成活率，花鱸和大黃魚的

3、上述指標隨植物油替代水平的升高而顯著降低。三種魚的肝指數(shù)不受飼料處理的顯著影響，但內臟指數(shù)隨著植物油替代魚油水平的升高而增加，且花鱸和大黃魚的肝臟脂肪含量隨植物油替代魚油水平的升高而顯著升高。隨著植物油替代魚油水平的升高，三種魚肌肉中的n-3 LC-PUFA的含量逐漸降低，但在虹鱒中，魚油組和50％植物油替代組中n-3 LC-PUFA的含量無顯著差異，而在肝組織中50％植物油替代組和植物油組沒有顯著差異，均顯著低于魚油組。隨著替代水平升

4、高，虹鱒、花鱸和大黃魚的肝細胞中脂肪滴累積程度逐漸增高，相同替代水平下大黃魚肝細胞中脂肪滴累積程度最為嚴重;腸道組織中杯狀細胞隨植物油替代水平升高而增多，而在大黃魚全植物油組出現(xiàn)脂肪滴累積和上皮細胞死亡現(xiàn)象。
　　2.虹鱒、花鱸和大黃魚△6FAD的基因啟動子克隆和生物信息學分析
　　利用基因步移方法，克隆到虹鱒、花鱸和大黃魚的△6FAD啟動子序列，長度分別為:1479 bp、2064 bp和996 bp。Blast比對顯示三

5、種魚的△6FAD啟動子序列與已提交NCBI的魚類△6FAD序列具有較高的保守性。多序列比對顯示，三種魚與大西洋鮭和歐洲鱸魚含有相同的轉錄因子結合位點NF-Y和SRE，但在虹鱒、鱸魚和大黃魚△6FAD啟動子中均未發(fā)現(xiàn)大西洋鮭所具有SP1結合位點。
　　3.虹鱒、花鱸和大黃魚轉錄因子SREBP-1和PPAR-α的cDNA全長克隆以及生物信息學分析
　　分別克隆得到虹鱒、花鱸和大黃魚的SREBP-1基因cDNA全長，其長度分別為4

6、220 bp、3797 bp和3750 bp。通過BLAST分析發(fā)現(xiàn)，虹鱒、花鱸和大黃魚的SREBP-1序列與已知魚類的SREBP-1具有較高的同源性，通過與人類SREBP-1的N端進行比對發(fā)現(xiàn)，魚類的SREBP-1與人類的SREBP-1a的相似度大于人類的SREBP-1c。SREBP-1的系統(tǒng)進化樹分析結果與傳統(tǒng)的分類學結果一致。
　　PPAR-α基因在虹鱒和花鱸中有兩個亞型，而在大黃魚中只存在一個。通過BLASTP分析和多序列

7、比對，發(fā)現(xiàn)PPAR-α1和PPAR-α2均與哺乳類具有較高同源性，具有相同的DNA-binding domain和ligand-binding domain結合位點。構建PPAR-α的系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，該進化樹明顯地分為兩支，擁有兩種PPAR-α基因的魚類，如花鱸、斑馬魚等，其兩個基因分別在進化樹的不同分枝上。這說明在魚類進化過程中，PPAR-α基因在部分魚類中發(fā)生了基因重復，可能基因亞型的功能也因此發(fā)生了分化。
　　4.飼料中植物

8、油替代魚油對虹鱒、花鱸和大黃魚△6FAD、SREBP-1和PPAR-α的mRNA表達的影響。
　　隨著植物油替代魚油水平的升高，虹鱒、花鱸和大黃魚△6FAD、SREBP-1和PPAR-α在肝臟中的mRNA表達逐漸升高，但在肌肉、脂肪和腸道組織中存在不同的結果。這可能是因為魚體的不同組織對植物油響應的程度以及脂肪酸的合成能力存在差異。植物油替代魚油后也促進了三種魚組織中SREBP-1的表達量，但在虹鱒的脂肪和腸道中，以及花鱸的肝臟和

9、肌肉中出現(xiàn)了SREBP-1基因的mRNA表達量隨著替代水平升高先降低再升高的趨勢。在虹鱒和大黃魚肝臟中，植物油替代魚油導致PPAR-α基因表達量升高，但是在花鱸的肝臟和肌肉中，卻出現(xiàn)了植物油抑制PPAR-α基因表達的現(xiàn)象，所以PPAR-α基因對植物油的響應在不同魚類中具有不同的效果。在花鱸腸道組織和大黃魚的肝臟和肌肉組織中，△6FAD分別與SREBP-1和PPAR-α的表達量存在顯著的正相關關系。
　　5.虹鱒、花鱸和大黃魚中轉錄

10、因子SREBP-1和PPAR-α基因對△6FAD的調控作用
　　在以上研究的基礎上，將三種魚的轉錄因子開放閱讀框分別連入載體PCS2+，構建表達質粒;將三種魚的△6FAD基因啟動子序列分別連入PGL3-Basic質粒中，構建報告質粒。將重組質粒PCS2-和PGL3-共轉染入HEK293T細胞中，通過檢測雙熒光素酶活性的比值來探討轉錄因子對△6FAD啟動子的調控活性的強弱。啟動子活性比較結果發(fā)現(xiàn)，虹鱒△6FAD啟動子的活性顯著高于花

11、鱸和大黃魚。在三種魚中轉錄因子SREBP-1對△6FAD啟動子都具有激活作用，但是激活程度具有差異，在虹鱒和大黃魚中激活程度約1.6倍，在花鱸中高達4.6倍。在三種魚類中，轉錄因子PPAR-α對△6FAD啟動子的具有不同的激活活性:在虹鱒中，只有PPAR-α2基因對△6FAD啟動子具有1.3倍的激活作用;在花鱸中PPAR-α1和-α2對△6FAD啟動子都具有激活作用，但激活的程度不高;在大黃魚中PPAR-α對△6FAD啟動子沒有顯著的激

12、活作用。
　　為進一步驗證轉錄因子SREBP-1和PPAR-α對△6FAD的調控作用，虹鱒中開展了RNA干擾實驗。實驗結果表明，虹鱒中轉錄因子SREBP-1和PPAR-α2的siRNA都成功干擾了相應基因的表達，并分別在干擾后4h和6h表達量達到最低。伴隨著轉錄因子表達量降低，△6FAD的表達也出現(xiàn)降低，并在轉錄因子SREBP-1和PPAR-α2表達量下降到最低點后的2h和6h達到表達最低水平。以上結果再次證明，虹鱒中SREBP-