核供體細胞體外培養(yǎng)及其對豬克隆胚生產(chǎn)效率的影響.pdf

1、體細胞核移植(SCNT)技術(shù)具有巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景，對于培育優(yōu)良畜種、生產(chǎn)同質(zhì)實驗動物、保護瀕危動物、進行治療性克隆和轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)等方面，均有重要理論意義和實用價值，現(xiàn)已有多種體細胞被用以獲得克隆后代。體細胞克隆豬在人類動物疾病模型和異種器官移植方面具有巨大的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力，已成為當今體細胞克隆領(lǐng)域研究的熱點，雖然體細胞克隆豬業(yè)已取得不少進展，但核移植技術(shù)仍存在許多問題，如總體效率低、流產(chǎn)率高及克隆動物異常發(fā)育等。在哺乳動物體細

2、胞核移植中，供體細胞是影響其效率的主要因素之一。該文著重從供核細胞體外培養(yǎng)、細胞類型、體外傳代次數(shù)等方面研究供核細胞及其對體細胞核移植效率的影響。 采用組織塊法和胰酶消化法分離培養(yǎng)4種供核體細胞：豬胎兒成纖維細胞、豬卵丘細胞、豬顆粒細胞及豬耳皮膚成纖維細胞。比較2種方法對上述4種體細胞的冷凍效果，方法A將細胞放在4℃冰箱中平衡0.5 h，-20℃2h，置于-70℃低溫冰箱中過夜后，將細胞冷凍管直接投入液氮中保存。方法B則用細胞冷

3、凍盒進行冷凍保存，將冷凍管放入NALGENE冷凍盒中，置于-70℃低溫冰箱中過夜后，將細胞冷凍管直接投入液氮中保存。在用于核移植以前，我們對細胞進行了連續(xù)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學變化；采用MTT法檢測其細胞活力，并繪制了細胞生長曲線；同時進行核型分析檢測。我們以體外成熟培養(yǎng)40～44 h的去核卵母細胞為受體，體外培養(yǎng)的胎兒成纖維細胞、卵丘細胞、顆粒細胞、耳皮膚成纖維細胞為核供體構(gòu)建重構(gòu)胚。重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)7d，觀察其卵裂率及胚胎發(fā)育情況。結(jié)果

4、表明： 1.在所培養(yǎng)的4種體細胞中，采用方法B的細胞存活率和貼壁率均明顯高于方法A(P<0.05)，方法B為體細胞冷凍保存的最佳方案。 2.所培養(yǎng)的4種體細胞在體外的生長增殖過程均呈“S”型曲線變化，經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)增長期和平臺期3個階段，符合細胞在體外生長的一般規(guī)律。傳代后滯留期較短，約有1d左右，活細胞逐漸貼壁生長。此后進入對數(shù)生長期，延續(xù)6d左右。培養(yǎng)8d后細胞發(fā)生接觸抑制而開始死亡，其數(shù)量進入平臺期，并逐漸脫落

5、死亡，導致數(shù)量下降。 3.染色體檢測表明，在適宜的培養(yǎng)體系胎兒成纖維細胞至少可以傳至8代并保持染色體倍性正常，卵丘細胞至少可以傳至5代并保持染色體倍性正常；顆粒細胞至少可以傳至5代并保持染色體倍性正常；耳皮膚成纖維細胞，至少可以傳至6代并保持染色體倍性正常。該結(jié)果表明，細胞經(jīng)傳代后均可保持核型穩(wěn)定正常，適合用作體細胞核移植的供核細胞。 4.本實驗采用豬胎兒成纖維細胞、卵丘細胞、顆粒細胞及耳皮膚成纖維細胞分別進行核移植，比

6、較不同細胞類型對豬體細胞核移植效率的影響，結(jié)果顯示核移植后都能得到體細胞克隆的桑囊胚，胎兒成纖維細胞(70.2％)、顆粒細胞(73.3％)和卵丘細胞(82.5％)作為核供體的卵裂率均顯著高于耳成纖維細胞(61.2％)；顆粒細胞(38.6％)和卵丘細胞(47.6％)所獲得的桑囊胚率顯著高于耳成纖維細胞(28.4％，P<0.05)。 5.以不同代次的豬胎兒成纖維細胞、顆粒細胞及耳成纖維細胞為核供體進行核移植，比較不同傳代次數(shù)對核移植

7、效率的影響。結(jié)果顯示以豬胎兒成纖維細胞不同培養(yǎng)代數(shù)做供體進行核移植，第2代的豬胎兒成纖維細胞(79.0％)作為核供體細胞獲得的卵裂率顯著高于第3代(58.1％，P<0.05)，而兩者獲得的桑椹胚、囊胚發(fā)育率差異不顯著。用傳至3代的顆粒細胞作核供體的卵裂率顯著低于原代及前2代細胞(P<0.05)；但在桑囊胚發(fā)育率上，第2代的細胞顯著高于其它代次(P<0.05)。用不同代次的耳成纖維細胞作為核供體獲得的卵裂率差異不顯著，但在桑囊胚發(fā)育率上，

8、原代(36.8％)及第3代細胞(44.1％)顯著高于第1代(10.5％)和第2代(13.5％)細胞(P<0.05)。 6.本實驗獲取作為供核細胞的豬卵丘細胞方法有2種。(1)直接從成熟卵母細胞周圍分離得到卵丘細胞；(2)卵丘細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)傳代4代的卵丘細胞，以重建胚早期發(fā)育率為指標，比較2種供核細胞對豬核移植效果的影響。結(jié)果表明，直接分離的卵丘細胞作為核供體獲得的卵裂率與培養(yǎng)傳代的卵丘細胞差異不顯著，而直接分離的卵丘細胞(47