Nesfatin-1對豬卵母細胞體外發(fā)育的影響.pdf

1、作為胚胎體外生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，動物卵母細胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM）和胚胎體外培養(yǎng)（In Vitro Culture，IVC）對畜牧生產(chǎn)、人類輔助生殖、發(fā)育機理研究等具有重要意義。發(fā)掘和解析影響卵母細胞、胚胎發(fā)育的調(diào)控因子，有助于完善培養(yǎng)基，提高胚胎生產(chǎn)效率。Nesfatin-1是新近發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控動物代謝的多肽，可能參與調(diào)控嚙齒類和魚類的生殖活動。但Nesfatin-1是否參與家畜生殖活動調(diào)節(jié)，影響卵母細

2、胞和胚胎發(fā)育至今未見報道。本研究旨在探討Nesfatin-1對豬卵母細胞和胚胎發(fā)育的作用，為優(yōu)化豬IVM、IVC培養(yǎng)基提供依據(jù)。首先，對已公布的豬基因組信息中預(yù)測的豬Nesfatin-1基因進行初步分析；其次，利用免疫組化技術(shù)檢測豬Nesfatin-1在卵巢組織細胞內(nèi)的表達與分布；然后，通過在培養(yǎng)基中添加，研究Nesfatin-1對豬卵母細胞和胚胎發(fā)育的影響。具體試驗及結(jié)果如下：
　　試驗一豬Nesfatin-1基因的生物信息學(xué)初

3、步分析。研究表明，豬Nesfatin-1基因位于2號染色體，由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成，全長151.8Kb；序列比對結(jié)果顯示：在氨基酸水平上，豬Nesfatin-1與人、大鼠的Nesfatin-1的同源性分別為92％和83%；核苷酸水平上，豬與人、大鼠的Nesfatin-1基因編碼區(qū)同源性分別為93%和96%。此外，進化樹聚類結(jié)果表明，豬Nesfatin-1與大鼠Nesfatin-1基因同源性最高。
　　試驗二豬卵巢組織細胞

4、內(nèi)Nesfatin-1的表達與分布。對卵巢組織切片進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示Nesfatin-1主要分布在卵丘顆粒細胞、壁層顆粒細胞及殼膜細胞。對原代培養(yǎng)顆粒細胞和殼膜細胞進行免疫熒光染色，結(jié)果表明Nesfatin-1在顆粒細胞和殼膜細胞中穩(wěn)定表達，且Nesfatin-1基因在豬卵丘卵母細胞復(fù)合物以及顆粒細胞中的表達量是隨著卵泡直徑的增大，呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。
　　試驗三Nesfatin-1對隨機選取的豬卵母細胞IVM的作用。在I

5、VM培養(yǎng)基中添加不同濃度的Nesfatin-1（對照組0ng/mL；實驗組0.1、1、10、100ng/mL）用于豬卵母細胞IVM，以研究Nesfatin-1對隨機選取的豬卵母細胞IVM的影響。結(jié)果表明，添加Nesfatin-1對隨機選取的豬卵母細胞成熟率、孤雌胚的卵裂率、囊胚率均無顯著影響。
　　試驗四Nesfatin-1對包裹不同程度顆粒細胞的卵母細胞IVM的影響。在IVM培養(yǎng)基中添加不同濃度Nesfatin-1（對照組0ng

6、/mL；實驗組1、10、100、1000ng/mL）用于培養(yǎng)顆粒細胞包裹>5層和顆粒細胞包裹<2層的豬卵母細胞，以探明 Nesfatin-1是否通過顆粒細胞影響卵細胞的成熟。結(jié)果顯示，添加Nesfatin-1對顆粒細胞包裹程度不同的豬卵母細胞成熟率、囊胚率均無顯著影響。
　　試驗五探明Nesfatin-1是否通過能量代謝影響卵母細胞成熟。在去除丙酮酸鈉的限定性培養(yǎng)基中添加不同濃度的Nesfatin-1（對照組0 ng/mL；實驗組

7、0.1、1、10、100ng/mL），再用于豬卵母細胞IVM。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL Nesfatin-1均能顯著提高豬卵母細胞的核成熟率。
　　試驗六Nesfatin-1對豬孤雌胚體外發(fā)育的影響。隨機選取成熟的卵母細胞進行孤雌激活，然后將孤雌胚隨機放入添加了不同濃度Nesfatin-1（對照組0ng/mL；實驗組0.1、1、10、100ng/mL）的非限定性胚胎培養(yǎng)基中進行IVC。結(jié)果表明，

8、添加0.1ng/mL Nesfatin-1明顯促進了豬孤雌胚的囊胚形成，而100ng/mL的Nesfatin-1顯著增加了豬孤雌胚囊胚總細胞數(shù)。
　　綜上所述，本研究探明了Nesfatin-1在豬卵巢上以及體外培養(yǎng)的顆粒細胞、殼膜細胞中的分布與表達模式；揭示了Nesfatin-1對豬卵母細胞成熟和孤雌胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1在培養(yǎng)基能量底物缺失時促進卵母細胞的發(fā)育，與顆粒細胞包裹卵母細胞的程度無關(guān)；此外，適宜濃度的