香煙煙霧經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導肺結構細胞凋亡促進慢性阻塞性肺疾病發(fā)生發(fā)展.pdf

1、【目的】初步研究香煙煙霧是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導肺結構細胞凋亡促進慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)生發(fā)展;
　　【方法】研究分為動物實驗和臨床實驗兩部分。
　　1.動物實驗部分:40只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、吸煙2個月組、吸煙4個月組和戒煙組(吸煙4個月然后戒煙1個月),采用單純被動吸煙法復制COPD模型,在各組相應的時間點通過測定肺通氣功能和觀察肺組織病理學變化對大鼠COPD模型進行評價。收集對照組和實驗組大鼠肺

2、組織標本,采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況,原位雜交和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測CHOPmRNA表達水平,并采用免疫組織化學、免疫印跡方法檢測PERK、P-PERK、CHOP蛋白質(zhì)表達水平。
　　2.臨床實驗部分:通過肺癌肺葉切除手術收集不吸煙非COPD、吸煙非COPD、吸煙COPD患者肺組織標本各10例;采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況,原位雜交檢測CHOPmRNA表達水平,并采用免疫組織化學檢測PERK、P-

3、PERK、CHOP蛋白質(zhì)表達水平。
　　【結果】
　?、?動物試驗部分結果
　　(1)吸煙2個月組大鼠0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)和呼氣峰流速(PEF)顯著低于對照組(FEV0.375.48±2.57(％) VS83.47±4.98(%),PEF33.42±3.21 VS40.11±3.66(ml/s) P均<0.05);吸煙4個月組大鼠肺通氣功能較吸煙2個月組進一步降低(FEV0.366.18±4.12(%)

4、 VS75.48±2.57(%),PEF25.89±2.22(ml/s)VS33.42±3.21(ml/s),P均<0.05);戒煙組與吸煙4個月組大鼠肺通氣功能無顯著性差異(P均>0.05)。
　　(2)肺組織病理學觀察結果:與對照組相比,吸煙兩個月組大鼠肺結構紊亂,部分肺泡出現(xiàn)破裂;吸煙四個月組大鼠肺結構紊亂更明顯,肺泡壁破裂,肺泡腔擴大,部分融合成肺大泡;戒煙組大鼠肺泡腔擴大較吸煙四個月組無顯著改變
　　(3) TUN

5、EL結果顯示:凋亡細胞主要是肺泡上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞和支氣管上皮細胞。對照組大鼠肺組織的凋亡率為11.442±1.724(%),在吸煙兩個月大鼠較對照組明顯升高(22.400±1.615(%) VS11.442±1.724(%),P<0.05),在吸煙四個月大鼠中則進一步明顯升高(34.830±3.201(%) VS22.400±1.615(%), P<0.05),在戒煙組大鼠稍微下降(P>0.05)。
　　(4)原位雜交結果顯

6、示CHOP主要定位于肺泡上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞,支氣管上皮細胞中,RT-PCR檢測結果示吸煙兩個月大鼠CHOP較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙四個月大鼠較兩個月大鼠比較則進一步顯著升高(P<0.05),而戒煙組大鼠與吸煙四個月大鼠相比較則沒有很大區(qū)別(P>0.05)。
　　(5)免疫組化結果顯示PERK主要表達于肺泡上皮細胞,支氣管上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞的胞漿,在對照組大鼠和吸煙組大鼠沒有顯著差別;P-PERK主要定位于肺泡

7、上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞,支氣管上皮細胞的胞漿,在對照組大鼠表達最低,吸煙兩個月大鼠表達較對照組顯著升高(P<0.05),吸煙四個月表達較吸煙兩個月大鼠明顯升高(P<0.05),而戒煙組大鼠較吸煙四個月組大鼠相比較則沒有顯著差別(P>0.05);而CHOP主要定位于肺泡上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞,支氣管上皮細胞的胞核中;吸煙兩個月大鼠CHOP較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙四個月大鼠較兩個月大鼠比較則進一步明顯升高(P<0.05),而戒

8、煙組大鼠與吸煙四個月大鼠相比較則沒有明顯差別(P>0.05);Western blot檢測結果和免疫組化一致。
　　(6)相關分析顯示細胞凋亡率、CHOPmRNA、CHOP蛋白以及P-PERK蛋白表達與肺功能呈負相關,細胞凋亡率與CHOPmRNA和蛋白呈正相關, CHOPmRNA表達與CHOP蛋白表達呈正相關,P-PERK蛋白表達與CHOP表達呈正相關。
　?、蚺R床試驗部分結果
　　(1)對照組第一秒用力呼氣容積與用力

9、肺活量的比值(FEV1.0/FVC(%))和FEV1占預計值百分比(FEV1(%))顯著高于吸煙組(FEV1.0/FVC(%)88±6.82(%) VS79.46±6.62(%),FEV1(%)89.31±6.06(%) VS81.4±6.83(%) P均<0.05);吸煙組肺通氣功能較 COPD組進一步降低(FEV1.0/FVC(%)79.46±6.62(%) VS58.54±6.23(%),FEV1(%)81.4±6.83(%) V

10、S63.50±7.20(%) P均<0.05)。
　　(2)肺組織病理學觀察結果:與對照組比,COPD組上皮層、平滑肌層增厚,肺泡結構紊亂,上皮細胞部分脫落,管壁大量炎癥細胞浸潤,肺泡管、肺泡囊及肺泡擴大,肺泡壁斷裂,可見部分肺泡融合成肺大泡。非COPD吸煙者肺組織結構與對照組無明顯差異。
　　(3) TUNEL結果顯示:凋亡細胞主要是肺泡上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞和支氣管上皮細胞。對照組人群肺組織的凋亡率最低12.5±2.8(

11、%),在吸煙非COPD組人群較對照組明顯升高(18.4±2.4(%) VS12.5±2.8(%),P<0.05),在吸煙COPD組人群中則進一步明顯升高(34.6±3.0(%) VS18.4±2.4(%),P<0.05),
　　(4)原位雜交結果顯示CHOP主要定位于肺泡上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞,支氣管上皮細胞中,檢測結果示吸煙非COPD較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙COPD組較吸煙非COPD組比較則進一步顯著升高(P<0.

12、05)。
　　(5)免疫組化結果顯示PERK主要表達于肺泡上皮細胞,支氣管上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞的胞漿,在非吸煙組人群和吸煙組人群沒有顯著差別;P-PERK主要定位于肺泡上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞,支氣管上皮細胞的胞漿;在對照組表達最低,吸煙非COPD組人群表達較對照組顯著升高(P<0.05),吸煙COPD組人群表達較吸煙非COPD組人群明顯升高(P<0.05);而CHOP蛋白主要定位于肺泡上皮細胞,血管內(nèi)皮細胞,支氣管上皮細胞的胞核

13、中;吸煙非COPD組人群CHOP較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙COPD組人群較吸煙非COPD組人群比較則進一步明顯升高(P<0.05)。
　　(6)相關分析顯示細胞凋亡率、CHOPmRNA、CHOP蛋白以及P-PERK蛋白表達與肺功能呈負相關,細胞凋亡率與CHOPmRNA和蛋白呈正相關, CHOPmRNA表達與CHOP蛋白表達呈正相關,P-PERK蛋白表達與CHOP表達呈正相關。
　　【結論】
　　1.PERK