sCAR-4N1融合蛋白的原核表達(dá)及在白血病治療中的研究.pdf

1、背景:白血病(Leukemia)又稱“血癌”,其作為一種常見的造血系統(tǒng)惡性疾病,是嚴(yán)重危害人類身體健康的惡性疾病之一。目前白血病的治療還是以化療、骨髓移植為主,但多數(shù)患者只能獲得短暫緩解,最終因復(fù)發(fā)或耐藥而死亡。Thrombospondins中文名血小板反應(yīng)蛋白,是一個(gè)胞外蛋白參與細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞矩陣通信的家族。Thrombospondin-1,是一種具有毒性從而促使癌細(xì)胞凋亡的蛋白,已有研究結(jié)果表明,TSP-1抑制白血病主要的作用部位

2、關(guān)鍵是TSP-1的羧基端4N1。CAR(Coxsackie and adenovirus receptor)為柯薩奇病毒腺病毒受體,它可與5型腺病毒所結(jié)合,從而介導(dǎo)5型腺病毒Ad-EGFP有效侵染白血病細(xì)胞。本課題立足于腫瘤靶向基因一病毒治療(Targeting Gene-Virotherapy)的策略,以溶瘤腺病毒為載體,根據(jù)thrombospondin-1(TSP-1)羧基端4N1氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受體s

3、CAR為模板,將8個(gè)氨基酸序列通過PCR擴(kuò)增于sCAR之后,得到目的序列sCAR-4N1,連接到表達(dá)載體pQE30上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15后獲得工程菌。該菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,高效表達(dá)出帶有組氨酸標(biāo)簽以包涵體形式存在的融合蛋白sCAR-4N1,用于抗白血病的研究。
　　 目的及意義:本課題根據(jù)白血病細(xì)胞表面表達(dá)CD47,而正常細(xì)胞表面CD47表達(dá)量相對(duì)較少的特點(diǎn),將其作為特異性清除白血病細(xì)胞的理想靶點(diǎn)。通過原核,表達(dá)純化出能夠特異

4、靶向白血病細(xì)胞的sCAR-4N1蛋白,該蛋白羧基端可以與白血病細(xì)胞表面的CD47整聯(lián),以達(dá)到靶向并有效侵染白血病細(xì)胞的作用。本課題構(gòu)建的融合蛋白sCAR-4N1,能夠抑制白血病細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡的作用。此外,本課題設(shè)計(jì)了攜帶4N1和IL-24兩個(gè)抑癌基因的5型腺病毒sCAR-4N1-IL-24,根據(jù)白血病細(xì)胞表面表達(dá)CD47,而正常細(xì)胞表面不表達(dá)CD47的特點(diǎn),設(shè)計(jì)并構(gòu)建了能夠特異靶向白血病細(xì)胞的溶瘤腺病毒Ad.hCMV-sCAR-

5、4N1-sp-E1A-△E1B-hCMV-IL-24,該病毒期望通過融合蛋白sCAR-4N1、Survivin啟動(dòng)子、IL-24三者的協(xié)同作用,清除白血病細(xì)胞,以期望達(dá)到治愈白血病的目的。
　　 方法:一、構(gòu)建攜帶融合基因sCAR-4N1的質(zhì)粒;二、融合蛋白sCAR-4N1原核表達(dá)并純化;三、通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白sCAR-4N1殺傷性;四、構(gòu)建包含兩個(gè)外源表達(dá)框(hCMV-sCAR-4N1和hCMV-IL-24)的穿梭質(zhì)粒;

6、五、HEK293細(xì)胞中通過同源重組包裝目的病毒,以用于以后白血病的抗癌效果研究。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建含融合基因sCAR-4N1質(zhì)粒,在大腸桿菌M15中成功表達(dá)sCAR-4N1融合蛋白sCAR-4N1。純化后進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明此蛋白能夠達(dá)到抑制白血病細(xì)胞K562增殖,并誘導(dǎo)其凋亡,且對(duì)正常細(xì)胞殺傷作用較小。
　　 結(jié)論:本課題通過原核表達(dá)成功純化的特異性靶向殺滅白血病細(xì)胞的融合蛋白sCAR-4N1體外抗白血病效果顯著,為