骨髓間充質(zhì)干細胞性別差異對急性肺栓塞治療效果的影響及機制.pdf

1、急性肺栓塞是臨床常見疾病,具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率,以及臨床表現(xiàn)的多樣化,成為治療的難點。目前,針對肺栓塞的治療措施以抗凝治療及溶栓治療為主。但是藥物治療存在著特異性差、半衰期短、副作用大等缺點。干細胞治療疾病的前景令人鼓舞,但目前的研究就其是否能夠促進血栓溶解還存在爭議,并且骨髓間充質(zhì)干細胞對急性肺栓塞的治療是否有效還未得到證實。本研究利用頸外靜脈注射血栓復(fù)制急性肺栓塞動物模型,然后用骨髓間充質(zhì)干細胞進行治療,發(fā)現(xiàn)治療有效。為

2、評估治療效果,在本研究中我們首創(chuàng)應(yīng)用全肺連續(xù)切片的方法統(tǒng)計實際存在的每個栓子的體積,并且與傳統(tǒng)的非連續(xù)切片統(tǒng)計血栓面積的方法進行比較,證實了對肺栓塞這種多血栓的情況進行定量評估時利用全肺連續(xù)切片的必要性。
　　多項研究報道細胞存在性別差異,且發(fā)現(xiàn)干細胞在治療多種疾病都表現(xiàn)為雌性干細胞比雄性干細胞更有優(yōu)勢。利用干細胞治療血栓的報道很多,但都未探討性別差異的問題。本研究首次探討不同性別的骨髓間充質(zhì)干細胞對急性肺栓塞的治療效果,發(fā)現(xiàn)雌性

3、骨髓間充質(zhì)干細胞具有更優(yōu)于雄性干細胞的治療效果。GAPDH作為一種管家蛋白除了參與糖酵解外,還參與包括DNA修復(fù)、tRNA轉(zhuǎn)運、膜融合轉(zhuǎn)運、細胞骨架構(gòu)建甚至細胞死亡等多種細胞生命活動的調(diào)節(jié)。有學(xué)者對大鼠腦部的研究發(fā)現(xiàn)GAPDH的表達存在性別差異。我們的實驗也證明正是雌、雄骨髓間充質(zhì)干細胞的GAPDH表達差異造成了其對急性肺栓塞的治療差異,具有較高GAPDH基礎(chǔ)水平的雌性干細胞對急性肺栓塞的治療效果更好,而GAPDH的這一作用,可能是通過

4、調(diào)控尿激酶型纖溶酶原激活物來實現(xiàn)的。
　　第一部分：不同性別來源的骨髓間充質(zhì)干細胞在急性肺栓塞治療中的作用
　　目的：
　　觀察不同性別骨髓間充質(zhì)干細胞對急性肺栓塞的治療作用。
　　方法：
　　利用小鼠頸外靜脈注射血栓復(fù)制急性肺栓塞的動物模型。造模后4h、8h及16h分組經(jīng)尾靜脈注射不同性別的骨髓間充質(zhì)干細胞2×106個,造模24h后處死小鼠,取肺固定包埋。全肺連續(xù)切片,HE染色,精確統(tǒng)計出現(xiàn)的所有栓子,并

5、通過體積計算方法分析治療差異。
　　結(jié)果：
　　1.成功復(fù)制急性肺栓塞的動物模型
　　模型組經(jīng)過血栓注射后24小時,通過切片染色可以看到非常明顯的血栓。利用連續(xù)切片體積分析方法對模型組和治療組所有的栓子進行分析,栓子體積主要集中于0.1-5×106μm3,利用非連續(xù)切片面積分析方法分析栓子面積主要位于1-10×103μm2間,兩種分析方法都顯示栓子在肺內(nèi)的分布右肺多于左肺,且主要位于0-30μm直徑的小血管內(nèi),這與臨床

6、血栓肺內(nèi)分布基本一致。
　　2.用總體積比用總面積分析多發(fā)血栓更加科學(xué)、合理;雌性和雄性骨髓間充質(zhì)干細胞均對急性肺栓塞有治療效果,且雌性骨髓間充質(zhì)干細胞更有優(yōu)勢。
　　用文獻常用的面積計算方法來分析模型動物肺血栓情況發(fā)現(xiàn),較連續(xù)切片體積計算法血栓總數(shù)漏掉了54％,但栓子的分布特點和臨床基本一致。用連續(xù)切片體積來分析,統(tǒng)計所有出現(xiàn)的栓子,更加精確和客觀。栓塞4h后治療,在雌性小鼠和雄性小鼠中,雌性和雄性骨髓間充質(zhì)干細胞均有效果

7、,且雌性骨髓間充質(zhì)干細胞治療效果更好;栓塞8h后治療,對于雌性小鼠,雌、雄骨髓間充質(zhì)干細胞均有效果,但未發(fā)現(xiàn)兩者的治療差異,而在雄性小鼠,雌、雄骨髓間充質(zhì)干細胞均有效果,且雌性骨髓間充質(zhì)干細胞治療效果更好;栓塞16h后治療,雌、雄骨髓間充質(zhì)干細胞對雌性小鼠均有效果,但兩者未發(fā)現(xiàn)治療差異,而在雄性小鼠,僅僅雌性骨髓間充質(zhì)干細胞治療有效。
　　結(jié)論：
　　利用頸外靜脈注入血栓法可以成功復(fù)制急性肺栓塞動物模型,復(fù)制的模型與臨床資料

8、肺血栓的分布基本一致,用這種復(fù)制血栓的方法來研究肺栓塞是可行可靠的。相對于文獻常用面積計算分析血栓的方法,我們獨創(chuàng)全肺連續(xù)切片計算血栓體積來分析的方法更加準確和客觀。雌、雄骨髓間充質(zhì)干細胞在肺血栓發(fā)生的早期治療均有效,且雌性骨髓間充質(zhì)干細胞治療效果更好;而在血栓發(fā)生的晚期,僅僅雌性骨髓間充質(zhì)干細胞治療有效。
　　第二部分：GAPDH在骨髓間充質(zhì)干細胞治療急性肺栓塞中的調(diào)控作用
　　目的：
　　確定GAPDH在調(diào)控雌、雄

9、骨髓間充質(zhì)干細胞治療急性肺栓塞效果差異中的作用,進一步探討骨髓間充質(zhì)干細胞治療急性肺栓塞的機制。
　　方法：
　　1.雌性骨髓間充質(zhì)干細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)GAPDH干擾的質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒,雄性骨髓間充質(zhì)干細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)GAPDH過表達的質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒,western blotting檢測各細胞中GAPDH的表達情況。
　　2.復(fù)制急性肺栓塞的動物模型。栓塞后4h分組注射調(diào)控了GAPDH表達的骨髓間充質(zhì)干細胞(F-BMSCs-siRNA-GAP

10、DH、F-BMSCs-siRNAvector、M-BMSCsOE-GAPDH、M-BMSCsOEvector)2×106個,20h后處死小鼠,取肺固定包埋。全肺連續(xù)切片,HE染色,精確統(tǒng)計出現(xiàn)的所有栓子,分析治療差異。
　　3.全肺連續(xù)切片中所有奇數(shù)片HE染色,發(fā)現(xiàn)有連續(xù)的片子出現(xiàn)血栓,其對應(yīng)的偶數(shù)片子做免疫熒光,對干細胞進行追蹤;western blotting檢測各細胞中uPA的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.GA

11、PDH穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的情況
　　未處理的雌性骨髓間充質(zhì)干細胞中GAPDH的基礎(chǔ)表達量要高于雄性骨髓間充質(zhì)干細胞;雌性骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染干擾GAPDH的質(zhì)粒后,其GAPDH表達量明顯減少;雄性骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染GAPDH過表達的質(zhì)粒后,其GAPDH表達量明顯增高。
　　2.GAPDH轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞對急性肺栓塞的治療情況
　　急性肺栓塞4h后開始干細胞治療,干擾GAPDH表達的雌性骨髓間充質(zhì)干細胞治療組的血栓體積明

12、顯大于單純雌性骨髓間充質(zhì)干細胞治療組,而GAPDH過表達的雄性骨髓間充質(zhì)干細胞治療組比單純雄性骨髓間充質(zhì)干細胞治療組血栓體積明顯減少,治療效果明顯增強。
　　3.干細胞追蹤及uPA表達情況
　　免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)綠色熒光標記的骨髓間充質(zhì)干細胞主要在血管內(nèi)栓子的外緣附著。雌性骨髓間充質(zhì)干細胞中uPA表達量高于雄性骨髓間充質(zhì)干細胞,GAPDH過表達以后的骨髓間充質(zhì)干細胞uPA表達量明顯增高。
　　結(jié)論：
　　雌性骨髓間

13、充質(zhì)干細胞具有比雄性骨髓間充質(zhì)干細胞更好地對肺血栓的治療效果,其原因可能是雌性骨髓間充質(zhì)干細胞中具有顯著的高于雄性骨髓間充質(zhì)干細胞的GAPDH表達量。通過干預(yù)GAPDH在雌雄骨髓間充質(zhì)干細胞的表達更驗證了雌、雄骨髓間充質(zhì)干細胞中GAPDH表達水平的不同是造成這兩種干細胞對急性肺栓塞治療差異的原因。
　　干細胞在血栓外緣的定位以及骨髓間充質(zhì)干細胞中GAPDH可以調(diào)控uPA的表達,說明急性肺栓塞的早期骨髓間充質(zhì)干細胞可能主要通過分泌一