肺動脈高壓細胞治療研究中骨髓間充質干細胞性別對療效的影響及其機制.pdf

1、肺動脈高壓(PAH)是一種嚴重且致命的疾病。其特點是肺動脈壓升高和肺的病理改變,如內皮損傷,肺血管平滑肌細胞增殖和遷移所導致的肺血管腔減小,以及最終伴發(fā)的右心室肥厚和終末期心臟衰竭。但是肺動脈高壓至今缺乏高效特異性的治療方法,盡管常規(guī)療法有顯著進步,預后卻仍然不理想。近年來干細胞被成功應用于多種疾病的治療。由于它所具有的,相比一般藥物治療更高的安全有效性,干細胞治療已成為疾病治療策略的研究熱點,并被運用于對肺動脈高壓的治療研究中。

2、>　　最近在脂肪分化、關節(jié)損傷等疾病模型中發(fā)現干細胞治療的療效存在性別差異。而對于干細胞治療肺動脈高壓效果的性別差異和其潛在的機制卻未有研究。本研究在探討骨髓間充質干細胞(BMSCs)治療肺動脈高壓性別差異的實驗中,發(fā)現雌性BMSCs無論以性別匹配或不匹配方式治療野百合堿(MCT)誘導的小鼠肺動脈高壓均比雄性BMSCs有更好的治療效果,表現為右心室肥厚和肺阻力血管肌化程度有更大幅度的降低。體外實驗中在炎癥、氧化應激狀態(tài)下,BMSCs的[

3、Ca2+]i動力學、增殖和遷移能力均有顯著的性別差異。
　　出乎意料的是,我們發(fā)現雌性BMSCs的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白水平比雄性BMSCs高得多。GAPDH最近已被證明是一種多功能蛋白質,具有不同的功能。我們通過分子生物學技術敲除雌性BMSCs的GAPDH或在雄性BMSCs過表達GAPDH,均能逆轉上述細胞生物學行為和治療效果的差異。綜上,我們的實驗結果表明GAPDH在雌性BMSCs通過調節(jié)細胞內[Ca2+]i

4、信號及相關的細胞行為,從而在治療肺動脈高壓過程中發(fā)揮比雄性BMSCs更加優(yōu)越的治療作用。
　　目的:
　　干細胞引入體內后,為特異性示蹤其定位與變化,現多采用將雄性干細胞引入雌性動物體內,藉由Y染色體來特異示蹤,因此不可避免地忽視了干細胞性別差異對治療效果的影響。本實驗利用分離自同胎生雌性和雄性小鼠的不同性別骨髓間充質干細胞(BMSCs),觀察干細胞性別差異對肺動脈高壓治療效果的影響。
　　方法:
　　本實驗采用

5、8周齡體重在22g左右的C57小鼠,尾靜脈注射60mg/kg的野百合堿MCT誘導肺動脈高壓模型,在MCT注射三天后分組靜脈給予2×106個不同性別BMSCs治療,28天后以右心肥厚指數RV/(LV+S)(右心室/(左心室+間隔))和肺組織病理切片所顯示的肺血管肌化程度(muscularization)為指標,評估治療效果。
　　結果:
　　(1)光學顯微鏡下可見單個BMSC呈梭形多角形,細胞融合后呈鋪路石樣;流式鑒定細胞表面

6、標志:CD29-PE+(99.96％±0.03%);CD34-PE-(0.34%±0.13%);CD45-APC-Cy7(1.97%±0.38%)。
　　(2)在對MCT誘導的肺動脈高壓治療中,雌性小鼠右心肥厚指數造模后明顯增加(0.278±0.009vs0.357±0.019,p<0.05),雌性BMSCs降低右心肥厚指數的作用表現出明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(0.275±0.026vs0.311±0.022,p<0.05);

7、且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同樣表現出明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(0.2835±0.028vs0.326±0.045,p<0.05)。
　　(3)在對MCT誘導的肺動脈高壓治療中,雌性小鼠肺動脈肌化(muscularization)造模后明顯增加(38.3%±2.9%vs82.3%±7.8%,p<0.05),但是雌性BMSCs降低肺動脈肌化的作用明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(41.7%±5.8%vs55.3%±5.0%,p<0

8、.05);且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同樣表現出明顯優(yōu)于雄性BMSCs的作用(40.0%±4.8%vs54.0%±6.9%,p<0.05)。
　　結論:
　　在MCT誘導的小鼠肺動脈高壓模型中,雌、雄BMSCs均可以有效減緩模型小鼠右心室肥厚和肺動脈肌化程度,從而起到有效治療肺動脈高壓的作用,而雌性BMSCs則表現出更優(yōu)于雄性BMSCs的治療效果。
　　目的:
　　骨髓間充質干細胞(BMSCs)在被引入發(fā)生肺動

9、脈高壓的人和動物體內后必然置身于不同的病理內環(huán)境,比較常見的包括氧化應激、炎癥反應等等。BMSCs要發(fā)揮其修復內皮和治療肺動脈高壓的作用,必須能夠適應這些微環(huán)境。觀察并比較在氧化應激、炎癥反應時雌、雄BMSCs生物學行為包括鈣信號、增殖和遷移能力、connexin43表達等方面的差異,以期闡明BMSCs在肺動脈高壓治療中表現出來的性別差異的機制。
　　方法:
　　用不同濃度(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/

10、L)的組胺和不同濃度(100μmol/L、250μmol/L、500μmol/L)過氧化氫(H2O2)刺激BMSCs,同時用實時熒光離子成像系統檢測[Ca2+]i變化,確定能夠使BMSCs表現出明顯不同的鈣信號差異的組胺和H2O2的濃度。用確定濃度后的組胺和H2O2刺激BMSCs,用MTS檢測BMSCs增殖,用transwell小室檢測遷移能力的差異,用westernblot方法觀察和比較雌、雄BMSCs中connexin43和GAPD

11、H的蛋白水平。
　　結果:
　　(1)組胺誘導雌、雄BMSCs的鈣反應:1μΜ組胺刺激雌性BMSCs(F-BMSCs)約78%細胞呈現典型的鈣振蕩,雄性BMSCs(M-BMSCs)71.4%細胞呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;10μΜ組胺刺激F-BMSCs約78%細胞呈現典型的鈣振蕩,74%M-BMSCs呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;100μΜ組胺刺激F-BMSCs約61%細胞呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,67.4%M-

12、BMSCs呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高。
　　(2)H2O2誘導雌、雄BMSCs的鈣反應:100μΜH2O2刺激雌性BMSCs(F-BMSCs)約81%細胞呈現典型的鈣振蕩,雄性BMSCs(M-BMSCs)79.5%細胞呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;250μΜH2O2刺激F-BMSCs約73.3%細胞呈現典型的鈣振蕩,75%M-BMSCs呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高;500μΜH2O2刺激F-BMSCs約73%細胞呈現典型的

13、鈣振蕩,79%M-BMSCs呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高。
　　(3)從雌、雄BMSCs增殖曲線可以看出,雌性BMSCs相比于雄性BMSCs增殖更快;在細胞生長滯后階段用10μM組胺和100μMH2O2刺激后細胞的增殖,雌、雄BMSCs在沒有刺激時增殖沒有明顯差異,但10μM組胺刺激后雌性BMSCs增殖加快,而雄性BMSCs增殖無明顯改變(1.42±0.08vs1.01±0.05,p<0.05),100μMH2O2刺激后雌性BM

14、SCs增殖也加快,而雄性BMSCs增殖無明顯改變(1.34±0.11vs0.94±0.06,p<0.05)。
　　(4)用10μM組胺和100μMH2O2刺激后細胞的遷移,雌性BMSCs沒有刺激時遷移每個視野細胞個數比雄性BMSCs多(32.6±5.8vs29.8±4.9,p<0.05),10μM組胺刺激后雌性BMSCs遷移細胞增加而雄性BMSCs無明顯改變(40.8±7.7vs30.4±4.0,p<0.05);100μMH2O2

15、刺激后雌性BMSCs遷移細胞增加而雄性BMSCs無明顯改變(42.3±8.4vs32.4±5.4,p<0.05)。
　　(5)組胺和H2O2刺激后BMSCs的Connexin43表達:雌、雄BMSCs在沒有刺激時Connexin43的磷酸化和非磷酸化表達沒有明顯差異,組胺刺激后雌性BMSCs磷酸化Connexin43(pCx43)增加而雄性BMSCs減少(1.83±0.44vs0.57±0.14,p<0.05),雌性BMSCs非磷

16、酸化Cx43(dpCx43)減少而雄性BMSCs增加(0.66±0.33vs1.46±0.19,p<0.05);H2O2刺激后雌性BMSCs磷酸化Connexin43(pCx43)增加而雄性BMSCs減少(1.65±0.27vs0.60±0.03,p<0.05),雌性BMSCs非磷酸化Cx43(dpCx43)而雄性BMSCs增加(0.89±0.19vs1.31±0.14,p<0.05)。
　　(6)組胺和H2O2刺激后BMSCs的

17、GAPDH表達:在無任何刺激時,雄性BMSCs的GAPDH基礎水平只有于雌性BMSCs的0.626±0.07倍(p<0.05);雌性BMSCs在組胺刺激后GAPDH表達增加1.38±0.15倍(p<0.05),在H2O2刺激后增加1.36±0.17倍(p<0.05);而雄性BMSCs則在上述刺激后均沒有發(fā)生明顯的GAPDH表達水平變化(vsM-BMSCsblankcontrol,p>0.05)。
　　結論:
　　在用H2O2

18、和/或組胺模擬體內氧化應激、炎癥狀態(tài)等刺激的體外試驗中,不同性別BMSCs在細胞增殖、遷移和[Ca2+]i的動力學等方面均具有顯著性差異。出乎意料的是,與雄性BMSCs相比,雌性BMSCs具有更高的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)蛋白表達水平。GAPDH最近已被證明是一種多功能蛋白質,具有不同的功能。我們提出GAPDH可能是BMSCs存在性別差異的關鍵因素。
　　目的:
　　為了探討GAPDH在骨髓間充質干細胞(BMSC

19、s)對小鼠肺動脈高壓治療中的關鍵作用,以及在體跟蹤BMSCs治療肺動脈高壓可能的機制。
　　方法:
　　分離純化同胎生不同性別C57小鼠的BMSCs,利用GAPDH的過表達(overexpression-GAPDH)或干擾質粒(siRNA-GAPDH)人為調控雌、雄BMSCs中GAPDH的表達,通過對細胞在[Ca2+]i\動力學、增殖和遷移能力等方面的檢測,評估GAPDH的表達對BMSCs生物學行為的影響。在體實驗利用MCT

20、誘導的肺動脈高壓小鼠模型,雌雄模型小鼠分組給予人為干預GAPDH表達的雌、雄BMSCs治療,并利用質粒本身所攜帶的GFP對干細胞進行示蹤,利用組織免疫熒光技術觀測BMSCs對血管內皮的修復。
　　結果:
　　(1)westernblot檢測轉染后BMSCs的GAPDH蛋白水平:干擾后雌性BMSCs的GAPDH的水平與雄性BMSCs的基礎水平沒有明顯差別,而過表達后的雄性BMSCs的GAPDH的水平明顯升高且與雌性BMSCs的

21、基礎水平沒有明顯差別。
　　(2)組胺和H2O2誘導轉染后BMSCs的鈣反應:10μΜ組胺刺激雌性BMSCs空質粒組(F-BMSCs+siRNAvector)約65%的胞呈現典型的鈣振蕩,雌性BMSCs干擾組(F-BMSCs+siRNA–GAPDH)約57%的細胞呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,雄性BMSCs空質粒組(M-BMSCs+overexpressionvector)約68%的細胞呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,雄性BMS

22、Cs過表達組(M-BMSCs+overexpression-GAPDH)約64%的細胞呈現典型的鈣振蕩;100μΜH2O2刺激F-BMSCs+siRNAvector約64%的細胞呈現典型的鈣振蕩,約71%的F-BMSCs+siRNA-GAPDH呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,約79%的M-BMSCs+overexpressionvector呈現典型的鈣峰之后持續(xù)的鈣升高,約60%的M-BMSCs+overexpression-GAPDH

23、呈現典型的鈣振蕩。
　　(3)組胺和H2O2誘導轉染后BMSCs的增殖和遷移:組胺和H2O2誘導干擾GAPDH的雌性BMSCs后增殖沒有明顯改變,而過表達GAPDH的雄性BMSCs則增殖加快(*p<0.05),有效地逆轉了雌、雄BMSCs增殖的差異;組胺和H2O2誘導干擾GAPDH的雌性BMSCs后遷移沒有明顯改變,而過表達GAPDH的雄性BMSCs則遷移加快(*p<0.05),有效地逆轉了雌、雄BMSCs遷移能力的差異。

24、　　(4)轉染后BMSCs治療小鼠肺動脈高壓的療效:過表達GAPDH的雄性BMSCs對于緩解MCT誘導的鼠肺動脈高壓模型右心室肥厚RV/(LV+S)優(yōu)于干擾GAPDH的雌性BMSCs(*p<0.05);過表達GAPDH的雄性BMSCs對于緩解MCT誘導的鼠肺動脈高壓模型的肺血管肌化程度優(yōu)于干擾GAPDH的雌性BMSCs(*p<0.05)。
　　(5)在體觀察轉染后BMSCs治療小鼠肺動脈高壓的療效:無論是雌性老鼠還是雄性老鼠,過表

25、達GAPDH的雄性BMSCs參與血管內皮的修復占血管總數的比例明顯升高(*p<0.05),干擾GAPDH的雌性BMSCs參與血管內皮的修復占血管總數的比例降低(*p<0.05)。
　　結論:
　　GAPDH最近已被證明是一種多功能蛋白質,具有不同的功能。我們通過分子生物學技術人為調控GAPDH在雌性和/或雄性BMSCs中的表達,有效逆轉了雌、雄BMSCs在生物學行為和對肺動脈高壓治療效果上的差異。在體示蹤技術顯示我們植入的B