HOTAIR 促進(jìn)卵巢上皮性癌惡性生物學(xué)行為及其機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌是繼宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的三大惡性腫瘤之一，其病死率高居婦科惡性腫瘤之首，由于起病隱匿、早期缺乏特異性癥狀與體征及有效的醫(yī)學(xué)篩查手段，約70％卵巢癌患者就診時已發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)的最佳時期，結(jié)果導(dǎo)致5年的總體生存率欠佳。早期卵巢癌（Ⅰ期和Ⅱ期）的遠(yuǎn)期生存率可達(dá)到80%～95%，相比之下，晚期卵巢癌（Ⅲ期和Ⅳ期）的遠(yuǎn)期生存率只有10%～30%。因此卵巢惡性腫瘤存在“兩個70%”：超過70%的患者確診時已屬晚期；約70%的患

2、者在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。故由此可見,尋找早期診斷及有效的治療方法對于卵巢癌患者的生存率至關(guān)重要。近幾年,學(xué)者們一直在尋找具有特異性的方法,以提高卵巢癌的生存率,保證患者的有效預(yù)后。另外一種學(xué)說“二元論模型”認(rèn)為，卵巢癌分為高級別和低級別兩類。高級別卵巢上皮性癌占卵巢癌發(fā)病的75%，占卵巢癌病死率的90%，其發(fā)病迅速，侵襲性極強(qiáng)，常伴發(fā)廣泛的盆腹腔轉(zhuǎn)移和種植，預(yù)后極差。而低級別卵巢上皮性癌發(fā)病緩慢，多經(jīng)歷良性、交界性和低度惡性的發(fā)展過程，多為早期

3、，預(yù)后較好。因此高級別卵巢上皮性癌由于極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，是威脅婦女健康的惡性腫瘤。然而其發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制不明。
　　近來，繼miRNA的大量研究之后，被稱為長鏈非編碼 RNA(longnon-coding RNA，lncRNA）的一類分子量大于200nt的非編碼 RNA被發(fā)現(xiàn)并逐漸受到越來越多的研究。因其對靶基因表達(dá)的調(diào)控作用，lncRNA參與了許多癌癥發(fā)生、發(fā)展的過程。近年來的研究表明lncRNA參與了轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)修飾

4、、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)運輸多種重要的調(diào)控。(此處圖片省略）圖1 LncRNA的調(diào)控
　　我們的前期研究，對44例卵巢癌組織及14例正常卵巢組織樣本采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)的方法檢測長鏈非編碼RNA HOTAIR mRNA的表達(dá)。結(jié)果卵巢癌組織中HOTAIR mRNA表達(dá)高于正常卵巢組織〔（1.26士0.27 vs.（0.14士0.09）〕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)，病理類型為低度分化及未分化的卵巢癌組織中HOTAI

5、R mRNA表達(dá)高于中-低、中一高及高度分化組織﹝（1.65士0.41) vs（0.39士0.l4)﹞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05)。結(jié)論卵巢癌組織中HOTA IR的表達(dá)增高，且癌組織分化越低，HOTA IR表達(dá)越高。提示HOTA IR有可能作為發(fā)現(xiàn)卵巢癌，并判斷其惡性程度的一個分子標(biāo)志，可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。但機(jī)制不清。因此本研究擬在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Hotair在卵巢癌中的作用及其機(jī)制。為Hotair在卵巢

6、癌中的作用以及精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　第一部分：HOTAIR促進(jìn)卵巢上皮性癌惡性生物學(xué)行為及其機(jī)制的研究
　　目的：研究沉默HOTAIR后對上皮性卵巢癌惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　?。?）qPCR檢測在HOTAIR在卵巢癌細(xì)胞株SKOV3,OVCAR3和A2780的表達(dá)情況。
　?。?）沉默HOTAIR后，劃痕實驗檢測卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，transwell檢測卵巢癌細(xì)胞侵襲能力，EdU檢

7、測卵巢癌細(xì)胞增殖能力。
　　結(jié)果：
　?。?）HOTAIR在SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中表達(dá)高于A2780細(xì)胞；
　?。?）沉默HOTAIR后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖能力降低；
　　結(jié)論：
　　沉默HOTAIR可以抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。
　　第二部分： HOTAIR通過miR-214和 miR-217調(diào)控PIK3R3參與卵巢癌惡性生物學(xué)行為
　　目的：
　

8、　探索HOTAIR影響卵巢癌惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制。
　　方法：
　?。?）生物信息學(xué)預(yù)測HOTAIR可能調(diào)控的ceRNA；
　?。?）qPCR檢測沉默HOTAIR后，PIK3R3的表達(dá)情況；同時檢測沉默PIK3R3后HOTAIR的表達(dá)情況；
　?。?）qPCR檢測沉默HOTAIR或PIK3R3后，miR-214和 miR-217表達(dá)情況；
　　（4）qPCR檢測miR-214和miR-217以及miR-

9、214和 miR-217 inhibitor對HOTAIR和PIK3R3的影響；
　?。?）雙熒光素酶報告基因檢測HOTAIR或PIK3R3是否是miR-214和 miR-217的直接靶點。
　?。?）免疫組化檢測PIK3R3在卵巢癌組織的表達(dá)情況；
　?。?）沉默PIK3R3后，檢測卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。
　　結(jié)果：
　?。?）生物信息學(xué)預(yù)測HOTAIR和PIK3R3互為ceRNA，HOTAI

10、R和PIK3R3是miR-214和 miR-217的潛在靶點；
　?。?）沉默HOTAIR后，PIK3R3表達(dá)降低；沉默PIK3R3后，HOTAIR表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；
　?。?）沉默HOTAIR或PIK3R3后，miR-214和 miR-217表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；
　　（4）轉(zhuǎn)染miR-214和 miR-217 mimics后，HOTAIR或PIK3R3表達(dá)降低；轉(zhuǎn)染miR-214和 miR-217 in

11、hibitor后，HOTAIR或PIK3R3表達(dá)增加；
　　（5）和對照組比較，共轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和pMIR-HOTAIR3’UTR后，熒光素酶活性明顯下降（P<0.05）；和對照組比較，共轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和MIR-HOTAIR3’UTRm后，熒光素酶活性無明顯改變（P>0.05）；共轉(zhuǎn)染miR-217 mimics和pMIR-HOTAIR3’UTR后，熒光素酶活性明顯下降（P<0.05）；和對照組

12、比較，共轉(zhuǎn)染miR-217 mimics和MIR-HOTAIR3’UTRm后，熒光素酶活性無明顯改變（P>0.05）；
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示，PIK3R3在卵巢漿液性癌和粘液性癌中表達(dá)高于正常卵巢組織；
　?。?）沉默PIK3R3后，SKOV3細(xì)胞增殖能力、轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力均受到抑制。
　　結(jié)論：
　　卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默HOTAIR基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力降低；HOTAIR通過miR-

13、214和 miR-217靶向PIK3R3調(diào)控卵巢癌SKOV3細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。
　　第三部分：沉默HOTAIR影響SKOV3體內(nèi)成瘤能力
　　目的：
　　探究HOTAIR在體內(nèi)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長的影響
　　方法：
　　（1）慢病毒載體構(gòu)建HOTAIR沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株，然后移植到裸鼠左側(cè)腋窩，觀察移植瘤生長情況；
　?。?）采用免疫組織化學(xué)檢測沉默HOTAIR基因后，裸鼠移植瘤中PIK3R3