抗根結(jié)線蟲(chóng)基因的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及黑籽南瓜再生體系的建立.pdf

1、根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne spp.)是專性植物寄生性病原生物,在根部侵染過(guò)程中對(duì)植物本身的基因進(jìn)行調(diào)控,以誘導(dǎo)植物細(xì)胞特化,形成特化的取食結(jié)構(gòu),危害2000多種植物；病害發(fā)生后,一般減產(chǎn)10％-20％,嚴(yán)重的達(dá)75％以上：有證據(jù)表明,每年導(dǎo)致農(nóng)作物和植物的損失超過(guò)1000億美元。近年來(lái),隨著對(duì)線蟲(chóng)侵染方式,植物自身抗病防御體系研究的不斷深入,以及分子生物學(xué)理論和生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展,為利用植物自身防御體系及線蟲(chóng)自身生理生化特點(diǎn)

2、,通過(guò)基因工程手段,建立一個(gè)具有高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的線蟲(chóng)綜合控防策略成為可能。為此,我們開(kāi)展了抗根結(jié)線蟲(chóng)基因工程的研究。本文主要研究結(jié)果如下： 1 克隆了受根結(jié)線蟲(chóng)誘導(dǎo)的根結(jié)特異性表達(dá)的啟動(dòng)子RKNIP,登陸GenBank號(hào)為DQ486886,模序分析表明,RKNIP500具有雙向啟動(dòng)子的功能,而RKNIP300不具有啟動(dòng)子的功能,但是存在大量的與啟動(dòng)子功能相關(guān)的元件,特別是具有25個(gè)在根內(nèi)特異性表達(dá)的元件。該啟動(dòng)子誘導(dǎo)抗根結(jié)線蟲(chóng)

3、基因在根結(jié)內(nèi)表達(dá),可是作物達(dá)到抗根結(jié)線蟲(chóng)的目的。 2 參照NCBI GenBank(accession number AF435976)OC-I序列,合成7條引物,并且設(shè)計(jì)突變位點(diǎn),然后利用重疊延伸技術(shù),克隆了完整的OC-I-Δ-D86突變基因。參照GenBank (DQ087264)公布的16D10編碼序列,設(shè)計(jì)了2條寡核苷酸序列用于合成16D10基因的雙鏈干擾序列,克隆進(jìn)了T載體中,命名為pGEM-T-RKNIP300-16

4、D10-33(簡(jiǎn)寫(xiě)為pTT33)。 3 為了便于研究抗線蟲(chóng)基因功能表達(dá)的差異研究,構(gòu)建了四個(gè)植物表達(dá)載體,分別為pRTO、pRO、pRT33、pRTOT33。其中pRTO為T(mén)obRB7△0.3:OC-I-ΔD86;pRO為CaMV35S:OC-I-ΔD86;pRT33為T(mén)obRB7△0.3:16D10-33; pRTOT33為CaMV35S: OC-I-ΔD86與Tob△0.3:16D10-33的雙價(jià)基因載體系統(tǒng)。為抗根結(jié)線蟲(chóng)植

5、物基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化研究打下了基礎(chǔ)。 4 將OC-IΔD86因克隆到原核表達(dá)載體pet21b中,在1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后5h,OC-IΔD86合基因在大腸桿菌中得到表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物處于可溶狀態(tài),其表達(dá)量占總蛋白的11.4％,可溶性蛋白的16.4％；利用Ni-NTA系統(tǒng)純化該蛋白并經(jīng)PEG20000濃縮；活性分析表明該蛋白酶抑制劑在體外表現(xiàn)出對(duì)木瓜蛋白酶明顯的抑制作用；制備了效價(jià)大于10000的鼠抗血清。這為抗根結(jié)線蟲(chóng)基因(

6、OC-IΔD86)的轉(zhuǎn)基因植株的驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。 5 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將三個(gè)載體pRTO、pRT33、pRO,分別轉(zhuǎn)入煙草,其中pRTO、pRO獲得了發(fā)育正常的再生植株；而轉(zhuǎn)pRT33基因的煙草表型發(fā)生變化,表現(xiàn)為葉片由橢圓形變?yōu)榱~形,且葉片叢生,葉色黃花,不能發(fā)育成正常植株。對(duì)轉(zhuǎn)pRTO基因的煙草植株進(jìn)行了PCR、SOUTHERN、ELISA檢測(cè)及表型檢測(cè),證明pRTO基因已成功轉(zhuǎn)入煙草中,并表達(dá)出了抗性蛋白,轉(zhuǎn)基因植株表

7、現(xiàn)了明顯的抗根結(jié)線蟲(chóng)的效果。 6 黑籽南瓜是一種非常優(yōu)良的瓜類嫁接砧木材料,單是不抗根結(jié)線蟲(chóng)。為了使其獲得抗根結(jié)線蟲(chóng)的特性,首先開(kāi)展黑子南瓜再生體系的研究。結(jié)果表明：以子葉為外植體,基本培養(yǎng)基為MS,合適的芽誘導(dǎo)激素濃度為BA(2.0mg/l)、TDZ(1.0mg/l)、ZT(2.0mg/l),不定芽再生率分別為91.67％、98.33％、91.67％,KT誘導(dǎo)效果較差；合適的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+0.25mg/L KT,80％-