RSV感染對人支氣管上皮細胞TSLP合成的影響及痰熱清的干預(yù)研究.pdf

1、研究背景:
　　 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起嬰幼兒呼吸道感染最重要的病原體，不僅可在急性期引起毛細支氣管炎或肺炎，還與哮喘密切相關(guān)。目前有關(guān)RSV感染引起急性喘息及持續(xù)性哮喘的發(fā)病機制尚未完全明確，胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin,TSLP)是近年發(fā)現(xiàn)的新型細胞因子，作為病毒感染與哮喘間的橋梁而倍受國內(nèi)外關(guān)注，TSLP來源

2、于胸腺基質(zhì)細胞和上皮細胞，特別是經(jīng)抗原激活的支氣管上皮細胞。TSLP通過OX40L受體來刺激炎癥性樹突細胞的生成，進而刺激幼稚CD4+T淋巴細胞增殖，在氣道周圍創(chuàng)造一個輔助T細胞(helper T lymphocyte，Th)2優(yōu)勢分化的微環(huán)境，分泌Th2型細胞因子，促發(fā)Th2炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致哮喘的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于毛細支氣管炎患兒體內(nèi)TSLP水平如何變化，以及RSV感染氣道上皮細胞后是否通過上調(diào)TSLP合成而促進趨化因子分泌，增加嗜酸性粒細

3、胞與中性粒細胞氣道浸潤，從而啟動氣道高反應(yīng)性和繼發(fā)哮喘，目前國內(nèi)外尚未見研究報道。迄今為止，尚無安全有效的抗RSV疫苗及治療藥物問世。痰熱清注射液作為復(fù)方中草藥注射劑，臨床應(yīng)用表明對呼吸道感染治療效果肯定，但目前尚未見痰熱清詳細抗病毒機理探討的研究報道。
　　 研究目的:
　　 1.系統(tǒng)觀察RSV不同TCID50和不同感染時間作用人支氣管上皮細胞(NormalHuman Bronchial Epithelium,NHBE

4、)的細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)，探討RSV感染NHBE的最佳條件，以成功建立RSV感染NHBE的體外模型，為進一步系統(tǒng)探討RSV感染分子生物學(xué)機制提供有效的體外研究手段。
　　 2.觀察RSV感染對人支氣管上皮細胞合成TSLP水平的影響，探討TSLP在RSV性毛細支氣管炎性急性喘息發(fā)病機制中的作用。
　　 3.將痰熱清以不同給藥方式、不同給藥時間干預(yù)RSV感染人支氣管上皮細胞，觀察其對TS

5、LP合成水平的影響，探討痰熱清對TSLP有無抑制作用。
　　 研究方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)和呼吸道合胞病毒擴增、定量：培養(yǎng)實驗所需的人喉癌上皮細胞株(Hep-2)、人支氣管上皮細胞(NHBE)。以RSV易感的Hep-2細胞進行病毒的繁殖、傳代、凍存，以TCID50方法測定病毒滴度。
　　 2.RSV感染NHBE體外模型的建立：將NHBE細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，取病毒懸液按每孔100 TCID50接種，動態(tài)觀

6、察接種24h、48h、72h、96h、120h后NHBE細胞形態(tài)學(xué)改變。并以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechain reaction，PCR)技術(shù)檢測NHBE細胞中RSV核酸基因表達情況，鑒定RSV是否感染成功。
　　 3.RSV對NHBE合成TSLP的影響：實驗分NHBE組(正常細胞對照組)和RSV感染組，感染組加入不同滴度的病毒，分別以TCID501000、500、100、50、10接種于6孔板中已長至85

7、％的NHBE。感染24h、48h、72h、96h、120h收集上清液，應(yīng)用競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay，ELISA)檢測上清液TSLP水平。
　　 4.痰熱清對RSV感染NHBE合成TSLP的影響：
　　 (1)藥物毒性測定：將NHBE接種于96孔板，加入10個稀釋度的藥物，每日記錄細胞病變結(jié)果，確定藥物的無毒性稀釋度。
　　 (2)痰熱清對RSV感染N

8、HBE后合成TSLP的影響：實驗分3組：①預(yù)防方式給藥組，病毒感染細胞前24 h給藥；②直接滅活病毒組，感染時給藥；③治療方式給藥組，病毒感染細胞lh后給藥。感染12h、24、48、72h收集細胞上清，應(yīng)用ELISA檢測上清液TSLP水平。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)方法：符合正態(tài)分布連續(xù)性計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差(X±s)表示，多組均數(shù)比較采用方差分析；非正態(tài)分布計量資料用全距(中位數(shù))表示，兩組均數(shù)比較采用秩和檢驗；P＜0.01有統(tǒng)計學(xué)

9、差異。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均使用SPSS11.5軟件包進行分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.RSV感染NHBE體外模型的建立：RSV接種于支氣管上皮細胞NHBE后，光學(xué)顯微鏡下觀察見細胞胞體增大，透亮度降低，小部分細胞呈壞死聚集狀。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)能從NHBE提取的總RNA中擴增出RSV病毒核酸的基因片段，證實RSV成功感染NHBE。根據(jù)系統(tǒng)觀察CPE，確定感染時間為72小時和TCID50為100是RSV感染NHBE的最佳條

10、件。
　　 2.RSV對NHBE合成TSLP的影響：NHBE-RSV(1000)組(530.69±1.18)接種后120h TSLP分泌水平最高，顯著高于接種后24h(150.73±1.55)、48h(140.33±2.12)、72h(347.99±1.53)和96h(440.95±1.23)(P均＜0.05)，并顯著高于NHBE-RSV(500)組(360.49±0.27)、NHBE-RSV(100)組(321.84±1.35

11、)、NHBE-RSV(50)組(261.38±2.22)、NHBE-RSV(10)組(114.92±1.63)、NHBE組(145.28±2.05)(P均＜0.05)。相同感染時間內(nèi)，隨著RSV感染滴度的增加，各感染組TSLP分泌水平均呈上升趨勢，且與NHBE(正常細胞對照)組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P均＜0.05)。相同感染滴度內(nèi)，隨著RSV感染時間的增加，各感染組TSLP分泌水平均呈上升趨勢，且與NHBE(正常細胞對照)組比較均有統(tǒng)計學(xué)

12、差異(P均＜0.05)。
　　 3.痰熱清對RSV感染NHBE合成TSLP的影響：經(jīng)藥物毒性測定，痰熱清、利巴韋林無毒性稀釋度分別為1:320、1:160。在4個不同給藥作用時間內(nèi)，痰熱清、利巴韋林不同的給藥方式組(預(yù)防給藥組、直接滅活組、治療給藥組)與病毒對照組比較，均能顯著降低RSV感染NHBE合成TSLP水平(P＜0.05)，并以預(yù)防給藥方式下調(diào)TSLP的作用最為明顯。預(yù)防給藥方式下，痰熱清組較利巴韋林組下調(diào)TSLP的作用

13、更明顯(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.RSV感染喉癌上皮細胞株(Hep-2)，Hep-2可出現(xiàn)典型的融合病變。RSV成功感染人支氣管上皮細胞株(NHBE)，NHBE僅出現(xiàn)細胞胞體增大，透亮度降低，壞死細胞增多成聚集狀，不形成典型的融合病變。感染滴度TCID50為100和感染時間為72h是RSV感染NHBE的最佳條件。
　　 2.RSV感染人支氣管上皮細胞可顯著上調(diào)TSLP合成水平。TSLP水平在感染后