甲醛染毒對人支氣管上皮細胞炎性因子影響及作用機制研究.pdf

1、【目的】
　　通過不同濃度甲醛染毒人支氣管上皮細胞16HBE，檢驗甲醛對人支氣管上皮細胞16HBE毒性，研究甲醛致哮喘機制中Th1/Th2/Th17類與TNF-α細胞因子間的變化規(guī)律與NF-κB、COX-2、JNK、ERK蛋白表達水平的影響，確定評估甲醛致哮喘作用及相關(guān)炎性因子生物標志物，探討甲醛致哮喘作用機制。
　　【方法】
　　1、甲醛染毒人支氣管上皮細胞16HBE增殖活性實驗
　　取對數(shù)生長期內(nèi)細胞接種于9

2、6孔板上，在37°，5％CO2條件下培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底，按實驗要求分6組甲醛染毒24小時（甲醛染毒濃度分別為0.04、0.08、0.16、0.32、0.64mmol/l，用無血清1640培養(yǎng)基與甲醛分析純配置），每個濃度設(shè)6個平行孔，用MTT法檢測人支氣管上皮細胞16HBE增殖活性并檢測半數(shù)致死量LC50。
　　2、人支氣管上皮細胞急性甲醛染毒2、4小時后細胞上清液中Th1類細胞因子變化研究
　　取對數(shù)生長期內(nèi)16 HB

3、E細胞接種于48孔板上，用無血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時后取細胞上清液高速離心后用ELISA試劑盒測Th1類細胞（IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ）因子含量研究人支氣管上皮細胞急性甲醛染毒后Th1類細胞因子作用變化。
　　3、人支氣管上皮細胞急性甲醛染毒2、4小時后細胞上清液中Th2類細胞

4、因子變化研究
　　取對數(shù)生長期內(nèi)16HBE細胞接種于48孔板上，用無血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時后取細胞上清液高速離心后用ELISA試劑盒測Th2類細胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-13）含量研究人支氣管上皮細胞急性甲醛染毒后Th2類細胞因子作用變化。
　　4、人支氣管上皮細胞急性甲

5、醛染毒2、4小時后細胞上清液中Th17類與TNF-α細胞因子變化研究
　　取對數(shù)生長期內(nèi)16HBE細胞接種于48孔板上，用無血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時后取細胞上清液高速離心后用ELISA試劑盒測Th17（IL-8、IL-17）與TNF-α細胞因子含量研究人支氣管上皮細胞急性甲醛染毒后Th17類及TN

6、F-α細胞因子作用變化。
　　5、用WESTERN BLOT法檢測甲醛染毒后16HBE細胞信號轉(zhuǎn)導通路蛋白NF-κB、COX-2、ERK表達變化
　　取對數(shù)生長期內(nèi)16HBE細胞接種于6孔板上，用無血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.32、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5% CO2無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時后提取細胞總蛋白后用 WESTERN BLOT法測NF-κ

7、B、COX-2、ERK的表達含量。
　　【結(jié)果】
　　1、人支氣管上皮細胞（16HBE）的細胞存活率與甲醛染毒劑量成反比關(guān)系。與對照組（0mmol/l）相比，0.32、0.64mmol/l劑量組的細胞存活率下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。甲醛對人支氣管上皮細胞（16HBE）的半數(shù)致死量濃度為0.4658mmol/l。
　　2、TH1類細胞因子檢測結(jié)果顯示：2小時甲醛染毒時，與對照組（0.00 mmol/l）

8、相比，0.04、0.16mmol/l甲醛染毒劑量組細胞上清液中IL-2含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），IFN-γ、IL-12組間變化均不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4小時甲醛染毒時，與對照組（0.00 mmol/l）相比，甲醛染毒劑量組內(nèi)IL-2、 IL-12含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與對照組（0.00 mmol/l）相比，IFN-γ組間變化不明顯差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　

9、3、TH2類細胞因子檢測結(jié)果顯示：2小時甲醛染毒時，與對照組（0.00 mmol/l）相比，染毒劑量組細胞上清液 IL-5含量升高，IL-6含量呈下降趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），IL-4、IL-10、IL-13組間變化不明顯差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4小時甲醛染毒時，與對照組（0.00 mmol/l）相比，1.2mmol/l劑量組內(nèi)IL-4含量升高，0.04、0.16、0.64劑量組內(nèi)IL-5含量升高，1.2mmo

10、l/l劑量組內(nèi)的IL-5含量降低、IL-6組間含量差異有統(tǒng)計學意義（ P<0.05）， IL-10、IL-13組間變化不明顯差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　4、TH17類與TNF-α細胞因子檢測結(jié)果顯示：2小時甲醛染毒時，與對照組（0.00 mmol/l）相比，染毒劑量組細胞上清液內(nèi) IL-8含量呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），IL-17、TNF-α組間變化不明顯差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4小時甲醛染

11、毒時，經(jīng)多因素方差分析，與對照組（0.00 mmol/l）相比，0.04、0.16mmol/l劑量組內(nèi)IL-8含量升高，繼續(xù)加大甲醛濃度后IL-8含量減少，各組間TNF-α含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），IL-17組間含量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　5、不同濃度的甲醛能明顯上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、COX-2的蛋白表達水平，并在一定程度上呈現(xiàn)劑量反應關(guān)系，但是對甲醛對ERK蛋白含量的表達并

12、無明顯的影響
　　【結(jié)論】
　　1、低劑量的甲醛對人支氣管上皮細胞增殖率有一定影響，當劑量加大時，會引起細胞死亡。
　　2、急性甲醛染毒可降低Th1類IL-2、IL-12含量，升高Th2類IL-4、IL-5含量，升高Th17類IL-8含量，升高TNF-α含量，加重氣道炎癥，從而促進哮喘的發(fā)生發(fā)展。
　　3、急性甲醛染毒可通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、COX-2、JNK、ERK的蛋白表達水平，促進炎性細胞的分泌