IFN-α佐劑在重組腺病毒-口蹄疫VP1疫苗免疫應(yīng)答中對Tfh的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：濾泡輔助性T細胞(Follicular T Helper cells，Tfh cells）是一類新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細胞亞群.Tfh細胞對生發(fā)中心（germinal center，GC）的形成，B細胞發(fā)育，抗體類別轉(zhuǎn)換和建立長期體液免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要的作用。干擾素-α（interferon-α，IFN-α）作為重組腺病毒疫苗的佐劑具有良好的免疫增強作用，但IFN-a是否通過介導(dǎo)Tfh細胞增強重組疫苗免疫應(yīng)答，還不清楚。本課題以IFN-

2、α作為口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）重組腺病毒疫苗的佐劑免疫小鼠，通過觀察其對Tfh細胞分化、生發(fā)中心形成、Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6 mRNA表達及血清中Tfh細胞主要細胞因子白細胞介素-21（interleukin-21，IL-21）分泌的影響，探討IFN-a佐劑在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中對Tfh細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，為進一步研究IFN-a作為佐劑免疫調(diào)節(jié)的新機制提供理論依據(jù)。
　　方法

3、：6周齡BALB/c小鼠，隨機分為四組，每組10只，分別為：免疫共表達FMDV VP1和豬IFN-a的重組腺病毒（rAd5VP1-2A-poIFN-a）組，單獨表達FMDV VP1的重組腺病毒（rAd5 VP1）和單獨表達豬IFN-a的重組腺病毒（rAd5poIFN-a）的聯(lián)合免疫組；rAd5VP1組和空載腺病毒Ad組作為對照；分別以腹腔注射的方式免疫小鼠，接種量為108TCID50/只。
　　1.在小鼠免疫重組腺病毒疫苗后7d，

4、取脾臟，分離淋巴細胞，通過流式細胞術(shù)檢測Tfh細胞（CD4+CXCR5+PD-1+）的分化情況；
　　2.在小鼠免疫重組腺病毒疫苗后7d，取脾臟，分離淋巴細胞，通過流式細胞術(shù)檢測生發(fā)中心B細胞（B220+GL-7+）的分化情況；
　　3.在小鼠免疫重組腺病毒疫苗后7d，取脾臟，分離淋巴細胞，提取RNA，通過real-time PCR技術(shù)檢測Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6 mRNA的表達水平；
　　4.在小鼠免疫重組腺病毒

5、疫苗后7d，取脾臟，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片,4μm,經(jīng)FITC-PNA抗體染色，免疫熒光顯微鏡技術(shù)觀察脾臟中GC（PNA+）的形成，經(jīng)Image J軟件分析平均熒光密度數(shù)值；
　　5.在小鼠免疫重組腺病毒疫苗后7d，小鼠眼球取血，分離血清，通過ELISA方法檢測血清中細胞因子IL-21的表達水平。
　　結(jié)果：1、IFN-a能明顯促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)Tfh細胞的增殖。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：小鼠免疫重組病毒7d

6、后，rAd5VP1-2A-poIFN-a組CXCR5+/CD4+細胞的比例（2.66%±0.16）和rAd5 VP1+rAd5po IFN-a組CXCR5+/CD4+細胞的比例（2.54%±0.44）明顯高于rAd5VP1組（1.29%±0.10），P<0.05；rAd5VP1-2A-poIFN-a組PD1+/CD4+細胞的比例（2.18%±0.38）和rAd5 VP1+rAd5po IFN-a組PD1+/CD4+細胞的比例（2.22%

7、±0.35）明顯高于rAd5VP1（1.49%±0.13），P<0.05；rAd5VP1-2A-poIFN-a組CXCR5+PD-1+/CD4+T的比例（2.22%±0.35）和rAd5VP1+rAd5poIFN-a組 CXCR5+PD-1+/CD4+T的比例（2.19%±0.37）明顯高于rAd5VP1組（1.49%±0.13），P<0.05。
　　2、IFN-a能明顯促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)GC B細胞的增殖。流式細胞術(shù)檢

8、測結(jié)果顯示：小鼠免疫重組病毒7d后，rAd5VP1-2A-poIFN-a組GL-7+/B220+細胞的比例（7.39%±0.38）和rAd5VP1+rAd5poIFN-a組GL-7+/B220+細胞的比例（4.44%±0.35）明顯高于rAd5VP1組（2.65%±0.28），P<0.05。
　　3、IFN-a能明顯促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)Bcl-6 mRNA水平的表達。小鼠免疫重組病毒7d后，通過Real time PCR檢

9、測BCL-6 mRNA表達水平，結(jié)果顯示：IFN-a能促進實驗組Bcl-6 mRNA的表達，與rAd5VP1組表達水平3.42±0.27相比，rAd5VP1-2A-poIFN-a組Bcl-6 mRNA表達水平為10.47±1.54，P<0.001，rAd5VP1+rAd5poIFN-a組Bcl-6 mRNA表達水平為9.647±1.790，P<0.01。
　　4、IFN-a能明顯促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)小鼠脾臟生發(fā)中心的形成。

10、脾臟石蠟切片經(jīng)FITC-PNA抗體染色，熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示：小鼠免疫重組病毒7d后，IFN-a能促進實驗組生發(fā)中心（PNA+）的形成，與rAd5VP1組平均熒光密度數(shù)值1.39±0.07相比， rAd5 VP1-2A-poIFN-a組平均熒光密度數(shù)值為2.41±0.32，P<0.01；rAd5VP1+rAd5poIFN-a組平均熒光密度數(shù)值為2.13±0.13，P<0.05。
　　5、IFN-a能明顯促進口蹄疫重組腺病毒疫苗

11、誘導(dǎo)IL-21的分泌。小鼠免疫重組病毒7d后，通過ELISA試劑盒檢測血清中IL-21分泌水平，結(jié)果顯示：IFN-a能促進實驗組血清中IL-21的分泌，與rAd5VP1組IL-21的表達水平63.68±13.15，pg/ml相比，rAd5VP1-2A-poIFN-a組IL-21的表達水平為149.50±32.74，pg/ml，P<0.01；rAd5VP1+rAd5poIFN-a組IL-21的表達水平為130.60±19.80，pg/ml

12、,P<0.05。
　　結(jié)論：IFN-a作為口蹄疫重組腺病毒疫苗佐劑，免疫小鼠的第7天，IFN-a能增強重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)Tfh細胞的增殖分化、促進生發(fā)中心的形成及促進GCB細胞的增殖分化，提高Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6 mRNA的表示水平，增強Tfh細胞主要細胞因子IL-21的分泌水平。實驗結(jié)果證實，IFN-a在口蹄疫重組腺病毒免疫應(yīng)答中對Tfh細胞的分化增殖發(fā)揮重要的免疫促進作用，為IFN-a佐劑在疫苗免疫應(yīng)答中發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)