花生四烯酸5-脂氧酶調(diào)節(jié)腦外傷和神經(jīng)突起生長的作用.pdf

1、5-脂氧酶(ECl.13.11.34,5-lipoxygenase,5-LOX)是機體催化花生四烯酸(arachidonic acid)生成白三烯類生物活性物質(zhì)的限速酶.5-LOx在靜息狀態(tài)下,分布于細胞漿和細胞核內(nèi),受到病理因素刺激后,轉(zhuǎn)位到細胞核膜代謝花生四烯酸生成產(chǎn)物白三烯(leukotrienes,LrS).近年來,5-LOX的分子生物學與細胞生物學研究取得了較大進展,提示5-LOX也可能作為一種細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白起著非酶作用.研究

2、表明,5-LOX在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布,并參與了許多神經(jīng)生理與病理過程. 腦外傷是成年人致死和致殘的重要原因.腦外傷為代表的腦損傷能夠?qū)е乱幌盗械膿p傷反應,這些反應可分為早期和后期(慢性)損傷反應.在損傷早期,主要的病理生理變化包括興奮性毒性,氧化應激,自由基產(chǎn)生,細胞凋亡,炎癥反應和變性.在損傷后期,主要的病理生理變化包括血管增生、神經(jīng)元再生、神經(jīng)環(huán)路重建、反應性神經(jīng)膠質(zhì)增生以及神經(jīng)膠質(zhì)疤痕形成(主要由增生的星形膠質(zhì)細胞組成

3、).有些后期變化(如血管增生,神經(jīng)元再生和神經(jīng)環(huán)路重建)有利于神經(jīng)功能恢復;有些變化(如反應性神經(jīng)膠質(zhì)增生以及膠質(zhì)疤痕)不利于恢復. 本論文旨在研究: (1)人腦外傷和星形膠質(zhì)瘤樣本中,5-LOx表達特點;(2)腦外傷動物模型(小鼠腦冷凍傷)中,5-LOX表達特點; (3)5-LOX抑制劑咖啡酸對小鼠腦冷凍傷的保護作用特點,尤其對損傷后期腦重構(gòu)的星形膠質(zhì)細胞增生和膠質(zhì)疤痕的作用特點; (4)5-LOX對NGF誘導后PC12細胞神

4、經(jīng)突起生長的影響,探討5-LOX參與腦損傷后神經(jīng)環(huán)路重建的作用.從以上幾個方面,闡明5-LOX在不同病理條件下的調(diào)節(jié)作用,以及作為神經(jīng)保護作用新的靶點的可能性. 第一部分人腦外傷和星形膠質(zhì)細胞瘤的5.脂氧酶表達特點腦損傷和腦腫瘤的腦組織中,5-LOX代謝產(chǎn)物白三烯的含量升高;有文獻報道,5-LDX在腦中廣泛分布,且5-LOX抑制劑具有神經(jīng)保護作用.然而,在人腦外傷以及腦星形膠質(zhì)細胞瘤中的5-LOX的表達特點,仍未得到研究.本研究

5、采用免疫組織化學方法研究在上述疾病中5-LOX腦內(nèi)表達特點.本研究發(fā)現(xiàn),在人腦相對正常的組織中,5-LOX表達在神經(jīng)元以及膠質(zhì)細胞上;未發(fā)現(xiàn)表達在腦微血管內(nèi)皮細胞上.神經(jīng)元中5-LOX有兩種表達模式:在細胞核和細胞漿內(nèi);只在細胞漿內(nèi).在人腦外傷標本中,5-LOX在膠質(zhì)細胞和中性粒細胞中表達增加;雙標免疫組織化學實驗,發(fā)現(xiàn)5-LOX表達在部分GFAP陽性細胞的星形膠質(zhì)細胞.在腦外傷后8天的病人樣本中,5-LOX表達在新生的腦血管內(nèi)皮細胞上

6、.另一方面,5-LOX高度表達在高度惡性的星形膠質(zhì)細胞瘤(Ⅲ/Ⅳ級)樣本上,并呈顆粒狀分布.這些結(jié)果顯示,5-LOX在神經(jīng)系統(tǒng)中有多種表達模式,在腦外傷和腫瘤可被誘導表達,提示5-LOX在人腦中有著重要的病理生理作用. 第二部分5-脂氧酶在小鼠腦冷凍傷后的表達及其抑制劑咖啡酸的保護作用腦外傷能夠引起早期的神經(jīng)元損傷以及后期的星形膠質(zhì)細胞增生和膠質(zhì)疤痕形成.近年來的研究提示,5-LOX可能參與了腦損傷和神經(jīng)退行性變的病理生理過程.

7、咖啡酸是一種天然的多酚化合物,具有5-LOX抑制作用.本研究采用腦外傷動物模型之一的小鼠腦冷凍傷模型,研究5-LOX在腦冷凍傷后的表達特點,并著重觀察5-LOX抑制劑咖啡酸在小鼠腦冷凍傷模型的早期(1天)和晚期(7～28天)的保護作用特點.雙標免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),在假手術(shù)小鼠大腦皮層,5-LOX主要表達在神經(jīng)元上.在冷凍傷14天后,損傷周邊區(qū)存活的神經(jīng)元中仍有5-LOX的表達;損傷周邊區(qū)大量增生的星形膠質(zhì)細胞中,5-LOX有很強的表達.咖

8、啡酸(10和50 mg/kg)能夠減少冷凍傷后1天、7天、14天、21天和28天5個時間點的損傷面積.在冷凍傷后期(7至28天),咖啡酸能夠減輕星形膠質(zhì)細胞的增殖、膠質(zhì)疤痕的形成以及GFAP的蛋白表達.另外,咖啡酸具有抗氧化特性,能夠抑制腦冷凍傷1天后的超氧化物歧化酶活性的降低,并降低丙二醛含量增高.這些結(jié)果提示,5-LOX在腦損傷的早期和后期具有重要的調(diào)節(jié)作用,可能成為腦損傷新的藥物作用靶點;具有腦損傷保護作用的咖啡酸可能成為治療早期

9、和后期腦損傷一個新的原型化合物. 第三部分5.脂氧酶參與神經(jīng)生長因子誘導的PC12細胞突起生長與外周神經(jīng)系統(tǒng)不同,成年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后,神經(jīng)軸突往往很難再生.因而,研究促進軸突再生的方法,對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如腦外傷、腦卒中和阿爾采默氏病等)的治療,具有重要意義.5-LOX細胞生物學研究發(fā)現(xiàn),5-LOX能與生長因子受體信號轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵蛋白相互作用,提示5-LOX可能作為一種細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白起著非酶作用.為闡明5-LOX在

10、腦損傷后神經(jīng)功能恢復中的可能作用,本研究使用神經(jīng)生長因子(NGF)誘導PCl2細胞分化模型,研究5-LOX調(diào)節(jié)神經(jīng)突起生長的作用特點.本研究用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和單克隆化技術(shù),建立了穩(wěn)定表達5-LOX-GFP融合蛋白和GFP的PCl2細胞株,命名為PC12-5-GFP和PC12-GFP細胞.經(jīng)NGF誘導的PC12-5-LOX-GFP細胞株,其神經(jīng)突起陽性細胞百分率,顯著地高于PC12野生型細胞和PC12-GFP細胞株.經(jīng)5-LOX反義寡核苷酸處理

11、,PC12野生型細胞5-LOX表達降低約40﹪,且在NGF誘導后,神經(jīng)突起陽性細胞百分率顯著地低于PC12野生型細胞.但是,脂氧酶抑制劑NDGA、5-LOX抑制劑咖啡酸、12-LOX抑制劑黃芩素和CysLTT1受體拮抗劑pranlukast,都不能降低NGF誘導后的神經(jīng)突起生長.這些結(jié)果提示,5-LOX在NGF誘導PC12細胞細胞分化的信號通路中,可能由其非酶作用參與調(diào)節(jié). 1.闡明了5-LOX在相對正常、腦外傷后和星形膠質(zhì)細胞

12、瘤中的表達特點.5-LOX在腦外傷中可能參與早期的損傷作用和后期的腦重構(gòu),以及星形膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)生. 2.闡明了小鼠腦冷凍傷損傷的時間過程,5-LOX在小鼠腦冷凍傷后的表達特點.5-LOX抑制劑咖啡酸對腦冷凍傷后早期和后期的神經(jīng)元損傷有保護作用,并能抑制后期膠質(zhì)疤痕形成.5-LOX參與調(diào)節(jié)腦損傷的早期和后期損傷,可能成為新的藥物作用靶點. 3.在過表達和低表達5-LOX-GFP融和蛋白的PC12細胞株,NGF誘導的PCI