PYK2在小鼠卵母細胞紡錘體組裝過程中的功能研究.pdf

1、PYK2是一種非受體型的的酪氨酸激酶，屬黏著斑激酶家族成員。其主要結(jié)構(gòu)包括：N末端的FERM結(jié)構(gòu)域,富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域,C末端黏著斑靶點(FAT domain)以及FRNK結(jié)構(gòu)域。PYK2有多個磷酸化的位點，包括Tyr402，Tyr579，Tyr580。其中，Tyr402位點可以接受細胞表面刺激發(fā)生自磷酸化,但Tyr579，580位點的活化需要二聚化以及鈣離子通路的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，PYK2可以響應多種細胞內(nèi)外信號而激活，參與多條信號通路

2、的傳遞，在細胞增殖、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。
　　在本研究中我們應用細胞免疫熒光、抑制劑處理、Westernblot等方法對Tyr402位點磷酸化的PYK2（以下簡稱P-PYK2）在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂紡錘體組裝過程中的定位和功能進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在小鼠GV期卵母細胞中，Tyr402磷酸化的PYK2主要集中在細胞核內(nèi),少量分布在細胞皮質(zhì)區(qū)。隨著GVBD的發(fā)生，目的蛋白分散到細胞質(zhì)中，起初圍繞在染色體周圍，隨著減數(shù)分裂的

3、進行，活化的PYK2離開染色體，逐漸集中到卵細胞的兩端，在MⅡ期卵子中，活化的PYK2定位在紡錘體的兩極。當磷酸化PYK2與α-Tubulin共同標記時發(fā)現(xiàn)：微管蛋白在GBVD后開始圍繞細胞染色體周圍聚集成微管球，P-PYK2與α-Tubulin聚集生成的部位重合。隨著卵子的成熟，染色體開始逐漸排列在赤道板上，微管蛋白逐漸呈束狀垂直于赤道板排列。而此時，P-PYK2向紡錘體的兩極移動，并逐漸聚集，而且始終與微管聚集發(fā)生部位密切相關。后期

4、剛開始時，PYK2仍在第一次減數(shù)分裂紡錘體兩極。末期，檢測不到P-PYK2(Tyr402)的特異性聚集。到MⅡ期，卵母細胞成熟，紡錘體的形成一個梭形的結(jié)構(gòu)，靠近細胞皮質(zhì)區(qū)域。此時P-PYK2幾乎全部定位在紡錘體的雙極區(qū)域。
　　用共聚焦顯微鏡檢測PYK2與γ-Tubulin的共同標記，發(fā)現(xiàn)P-PYK2與γ-Tubulin是一種共定位的位置關系，說明 PYK2可能作為微管組織中心的成分之一參與了紡錘體的組裝。為了進一步研究PYK2與

5、紡錘體組裝的關系，我們用PYK2酪氨酸激酶抑制劑處理小鼠卵細胞，當P-PYK2(Tyr402)活性受抑制后，免疫熒光標記α-Tubulin顯示小鼠卵母細胞中的紡錘體形態(tài)異常，與對照組相比，紡錘體的兩極不能很好的聚合，一些卵母細胞內(nèi)紡錘體的面積過大或過小。Western blotting等結(jié)果顯示微管蛋白（α-Tubulin）表達量也受到顯著影響。以上這些數(shù)據(jù)表明P-PYK2(Tyr402)表達受抑制后，紡錘體的組裝也受到影響，不能形成正