體外成熟卵母細胞線粒體和紡錘體的功能和形態(tài)變化研究.pdf

1、卵母細胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養(yǎng)技術在自然周期或使用少量促性腺激素的周期，將不成熟的卵母細胞在體外培養(yǎng)成熟，進行體外受精和胚胎移植，它克服了促排卵藥物的副作用，是今后助孕技術發(fā)展的趨勢之一。卵母細胞能在體外成熟和受精，并且胚胎移植后可成功妊娠，但體外成熟率和受精率低，胚胎發(fā)育阻滯率高，囊胚形成率及妊娠率低。這提示體外成熟的卵母細胞存在著細胞質成熟欠缺或核漿成熟不協(xié)調的問題，這是目前制約IVM技術廣泛

2、應用的主要障礙，因此繼續(xù)深入認識卵母細胞的成熟規(guī)律和改善體外成熟培養(yǎng)環(huán)境是當前的主要研究方向。 卵母細胞內在的質量是其發(fā)育到優(yōu)質胚胎的決定性因素，對卵母細胞中線粒體增殖、功能和動態(tài)分布的探討有助于對體外成熟卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育異常的了解。線粒體通過氧化磷酸化合成ATP，是有核細胞能量的主要來源。足量的ATP是卵母細胞完成第一次減少分裂的關鍵因素。線粒體還是卵母細胞內鈣離子活動的調節(jié)和儲存器，在卵母細胞發(fā)育和成熟過程中，線

3、粒體動態(tài)分布于微管等周圍提供ATP和鈣離子，促進胞內細胞器和骨架重組完成。卵胞漿內的線粒體對卵母細胞成熟、受精及以后胚胎的發(fā)育起著重要的作用。一旦卵母細胞啟動成熟進程，線粒體開始聚集在紡錘體和皮質層，提供ATP和鈣離子促進細胞骨架和胞漿的運動。影響線粒體功能和線粒體在卵母細胞紡錘體周圍聚集的化學物質都可引起減數分裂停滯、延遲，以及染色體的提前分裂或不分離。紡錘體是卵母細胞的一個重要組成部分，在細胞分裂過程中，紡錘體對卵母細胞染色體的平衡

4、、運動、分配和極體的排出有非常重要的作用。紡錘體異常，會導致異常的減數分裂，有可能產生異常的胚胎。它的形態(tài)學變化可能反映了體外培養(yǎng)環(huán)境中卵母細胞的質量。Polscope利用細胞內大分子結構的雙折射性，將光學硬件和數字傳導結合起來使紡錘體成像。目前Polscope已用來研究鼠和人的卵母細胞，其獲取的紡錘體結構信息與傳統(tǒng)固定和熒光免疫方法有高度一致性，對于卵母細胞觀察具有非侵襲性，認為可以評價卵母細胞的質量及其以后胚胎的發(fā)育潛能。

5、第1章線粒體對卵母細胞體外成熟及其發(fā)育潛能的影響。 目的：線粒體數量少、功能和動態(tài)分布的異常改變可能是體外成熟卵母細胞體外成熟率、受精率及妊娠率低的主要原因之一。這一部分研究將培養(yǎng)SD大鼠竇狀卵泡來源的卵母細胞，觀察體外成熟和卵泡大小對卵母細胞發(fā)育潛能的影響，卵母細胞線粒體的增殖、功能和動態(tài)分布是否存在異常改變，探討卵母細胞線粒體的增殖、功能和動態(tài)分布對卵母細胞體外成熟和發(fā)育潛能的影響。 材料和方法：實驗采用25天大小的

6、未成熟SD大鼠，收集直徑300-400μm和600-800 μm大小卵泡的卵母細胞卵丘顆粒細胞復合體(oocyte cumulus cellscomplex，COCs)進行體外成熟。采用實時定量PCR檢測線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體在卵母細胞中的分布，luminator檢測ATP含量，并比較體內成熟卵母細胞和各組體外成熟卵母細胞的成熟、受精和其胚胎繼續(xù)發(fā)育能力。

7、 結果：未成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數和其竇狀卵泡的直徑呈顯著的線性相關(P<0.01)，R=0.68；未成熟卵母細胞的ATP含量和其竇狀卵泡的直徑也呈顯著的線性相關(P<0.05)，R=0.21。體內成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數(103531±25305)和從直徑600-800 μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數(85061μ37937)顯著高于從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體

8、外培養(yǎng)成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數(68221±22311，P<0.01)。較成熟卵母細胞，未成熟卵母細胞的的mtDNA拷貝數最少(48689±22464，P<0.01)。體內成熟卵母細胞和從直徑600-800μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細胞的受精率、卵裂率和囊胚形成率顯著高于從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細胞的受精率、卵裂率和4細胞胚胎形成率(P<0.05)。體內成熟卵母細胞的A

9、TP含量(1.02±0.15 pmol)和從直徑600-800μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細胞的ATP含量(0.95±0.16 pmol)顯著高于從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細胞的ATP含量(0.85±0.23 pmol，P<0.05)。較成熟卵母細胞，未成熟卵母細胞的的ATP含量最少(0.62±0.14 pmol，P<0.01)。采用FCCP降低卵母細胞中ATP的含量，卵母細胞的

10、成熟率顯著降低(P<0.05)。 體內成熟卵母細胞、從直徑600-800μm大小竇狀卵泡和從直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細胞紅色熒光強度/綠色熒光強度的比率分別為0.169、0.169和O.164(p>0.05)。較成熟卵母細胞，未成熟卵母細胞紅色熒光強度/綠色熒光強度的比率最低(0.146，P<0.05)。較直徑300-400μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞，體內成熟卵母

11、細胞和直徑600-800μm大小竇狀卵泡分離出COCs體外培養(yǎng)成熟卵母細胞的線粒體常分布于卵周皮質區(qū)。 第2章體外成熟人卵母細胞中線粒體DNA和ATP含量對紡錘體PoISCOpe觀察的影響。 目的：研究將探討體外成熟人卵母細胞中mtDNA和ATP含量對紡錘體PolScope觀察的影響，紡錘體與人卵母細胞質量的關系。 材料和方法：收集和培養(yǎng)ICSI治療周期GV期卵母細胞，采用紡錘體成像系統(tǒng)PolScope觀察紡錘體

12、，實時定量PCR檢測mtDNA拷貝數，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體在卵母細胞中的分布，luminator檢測ATP含量，比較PolScope觀察有無紡錘體的成熟卵母細胞mtDNA和ATP含量、成熟、受精和其胚胎發(fā)育能力。 結果：收集了155個ICSI治療周期GV期卵母細胞，培養(yǎng)48小時后117個卵母細胞排除第一極體，成熟率為75.5﹪，其中51.3﹪(60/117)體外成熟卵在紡錘體成像系統(tǒng)PolScope下可觀察到紡錘體。在IV

13、F治療周期中，受精失敗的體內成熟卵母細胞的：mtDNA拷貝數(715708±254492)顯著高于ICSI治療中GV期體外成熟的卵母細胞的mtDNA拷貝數(526309±209099，P<0.05)。在ICSI治療中GV期卵母細胞體外成熟中，成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數和ATP含量(1.82±0.39 pmol)分別顯著高于未成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數(398441±159610)和ATP含量(1.33±0.34 pmol)。

14、 可檢測到紡錘體的成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數和ATP含量分別顯著高于未檢測到紡錘體的成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數和ATP含量(P<0.05)?？蓹z測到紡錘體的成熟卵母細胞的正常受精率和胚胎發(fā)育能力顯著高于未檢測到紡錘體的成熟卵母細胞的正常受精率和胚胎發(fā)育能力(P<0.05)。GV期卵母細胞體外成熟后行ICSI受精，受精失敗卵母細胞的mtDNA拷貝數(4264044-205454)顯著低于受精后第三天低發(fā)育潛能胚胎的mtDNA拷

15、貝數(5923934-190819)和優(yōu)質胚胎的mtDNA拷貝數(693350±180457)。 在體外培養(yǎng)液中加入FCCP后，GV期卵母細胞的體外成熟率顯著降低(P<0.001)。在FCCP處理組中，體外成熟的卵母細胞的紡錘體檢測率為23.1﹪，顯著低于無FCCP處理組體外成熟卵母細胞紡錘體的檢測率為51.3﹪(P<0.05)。此外，在FCCP處理組中，體外成熟的卵母細胞的ATP含量也顯著低于無FCCP處理組體外成熟卵母細胞的

16、ATP含量(P<0.05)。在FCCP處理組中，可檢測到紡錘體的6個成熟卵母細胞的ATP含量(1.79±0.28 pmol)明顯高于未檢測到紡錘體的20成熟卵母細胞的ATP含量(1.56±0.32 pmol)，因試驗標本量較小，未達到統(tǒng)計學差異(P=0.15)。而未成熟卵母細胞的ATP含量顯著低于成熟卵母細胞的ATP含量(1.00±0.36 pmol，P<0.01)。 結論： (1)盡管小竇狀卵泡的卵母細胞可體外成熟，但