豬α干擾素和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)口蹄疫病毒VP1抗原的免疫增強(qiáng)作用研究.pdf

1、口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、高度接觸性傳染病，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，傳統(tǒng)的口蹄疫滅活疫苗，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體、保護(hù)動(dòng)物免受FMDV的攻擊，在口蹄疫的控制和清除過(guò)程中起著重要的作用.然而，傳統(tǒng)的滅活疫苗需要增殖和滅活病毒，這就需要必須的設(shè)備條件而存在著病毒逃逸和滅活不徹底的危險(xiǎn)性，存在著明顯的生物安全問(wèn)題，因此研究新型的疫苗控制該病顯得尤為重要.FMDV屬微RNA病毒科口蹄疫病毒屬.FMDV完整的

2、病毒顆粒由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60個(gè)拷貝構(gòu)成的衣殼包裹一條單股正鏈RNA組成。大量的研究表明VP1上含有很多B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和自然宿主產(chǎn)生中和抗體，是FMDV主要的抗原蛋白.但是，VP1通過(guò)不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)只能產(chǎn)生低水平的中和抗體和較低的保護(hù)力。 本研究首次設(shè)計(jì)構(gòu)建了豬0型口蹄疫病毒多表位VPe蛋白(VP1上的(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨基酸)、VP1蛋

3、白分別與豬α干擾素、豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GMCSF串聯(lián)融合表達(dá)的重組腺病毒(rAd-pIFNα-VPe、rAd-pIFNα-VP1、rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1).首先在小鼠上測(cè)定了這幾株重組腺病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力，然后在豚鼠和豬體上衡量了其免疫攻毒保護(hù)力.研究結(jié)果證實(shí)pIFNα和GMCSF對(duì)FMDV的VP1抗原有明顯的免疫增強(qiáng)作用。 本研究?jī)?nèi)容分為以下5個(gè)部分： 1.0型FMDV

4、VP1蛋白的原核表達(dá)與鑒定 利用RT-PCR擴(kuò)增得到VP1蛋白基因并克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-YP1.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并用鎳柱親和層析法獲得了純化蛋白，用豬0型FMDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和VP1的單抗進(jìn)行Western-blot和iELISA檢測(cè)，證明該目的蛋白具有FMDV VP1蛋白的抗原性，該重組VP1蛋白的成功表達(dá)與鑒定為FMDV免疫血清

5、學(xué)抗體檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。 2.豬α干擾素重組腺病毒的構(gòu)建及其抗口蹄疫病毒活性研究 利用RT-PCR方法擴(kuò)增豬α干擾素成熟蛋白基因后構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAd-pIFNα，經(jīng)Pacl酶切后轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，3次噬斑純化后獲得了重組腺病毒rAd-pIFNα.該重組腺病毒于HEK-293A細(xì)胞連續(xù)傳代至20代滴度穩(wěn)定，為1010.0TCID50/mL.RT-PCR檢測(cè)證明目的基因在mRNA水平上可有效表達(dá)；在PK-15細(xì)

6、胞上可以檢測(cè)到較強(qiáng)的抗豬口蹄疫病毒活性，從而為研究豬口蹄疫免疫防治新技術(shù)奠定了重要基礎(chǔ)。 3.串聯(lián)表達(dá)豬α干擾素與FMDV VP1蛋白的重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性研究 將編碼豬α干擾素成熟蛋白和FMDV VP1蛋白的基因分別插入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，構(gòu)建了串聯(lián)表達(dá)pIFNα與FMDV VP1蛋白的重組腺病毒，在小鼠上測(cè)定了其免疫原性。第1-3組BALB/c小鼠分別皮下免疫rAd-VP1、rAd-pIFN

7、α+rAd-YP1和rAd-pIFNa-VP1，笫4-6組分別免疫rAd-pIFNα、野生型腺病毒(wtAd)和PBS作為對(duì)照，間隔2周加強(qiáng)免疫1次。結(jié)果表明，免疫rAd-pIFNα-VP1的小鼠的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平明顯高于rAd-pIFNα+rAd-VP1免疫組(P<0.05).4組豚鼠分別后腿肌肉注射rAd-pIFNα-VP1、滅活苗、wtAd和PBS，間隔2周加強(qiáng)免疫1次.結(jié)果表明，雖然rAd-pIFNα-VP1免疫組

8、的中和抗體水平(1:32-1:40)低于滅活苗免疫組(1:64-1:128)，但是rAd-pIFNα-VP1免疫組和滅活苗免疫組的所有豚鼠都能夠抵抗口蹄疫病毒的攻擊.該重組腺病毒rAd-pIFNα-VP1的成功構(gòu)建為口蹄疫基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ). 4.串聯(lián)表達(dá)豬α干擾素與FMDV VP1多表位抗原的重組腺病毒的構(gòu)建與免疫保護(hù)作用研究 選取FMDV VP1上的(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨

9、基酸(為FMDV的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位)，設(shè)計(jì)了FMDV多抗原表位的目的蛋白(VPe)基因，構(gòu)建了串聯(lián)融合表達(dá)口蹄疫病毒多表位(VPe)與pIFNα的重組腺病毒rAd-pIFNα-VPe，在小鼠上測(cè)定了其免疫原性.6組BALB/c小鼠間隔2周皮下免疫兩次，測(cè)定其體液免疫和細(xì)胞免疫水平.然后在豚鼠和豬上做了攻毒保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)了rAd-pIFNα-VPe的免疫保護(hù)力.結(jié)果表明，免疫rAd-VPe的小鼠能夠產(chǎn)生針對(duì)FMDV的特異性的體液免疫應(yīng)答和

10、細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且這種免疫應(yīng)答在聯(lián)合注射rAd-pIFNα+rAd-VPe的免疫組得到了加強(qiáng).更為重要的是，免疫rAd-pIFNα-VPe的小鼠的免疫應(yīng)答水平明顯高于rAd-pIFNα+rAd-VPe免疫組(P<0.05).免疫rAd-pIFNα-VPe的所有豚鼠和豬都能夠抵抗口蹄疫病毒的攻擊.該結(jié)果表明，rAd-pIFNα-VPe有可能成為預(yù)防口蹄疫病毒感染的疫苗候選分子。 5.串聯(lián)表達(dá)豬GMCSF與VPe或VP1的重組腺病毒

11、的構(gòu)建與免疫特性研究 利用RT-PCR擴(kuò)增出豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)成熟蛋白的基因后，按正確的閱讀框與口蹄疫病毒多表位VPe蛋白或者VP1蛋白的基因串聯(lián)，成功構(gòu)建了穿梭載體pShuttle-CMV-GMCSF-VPe和pShuttle-CMV-GMCSF-VP1，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確。Pmel酶切線性化后在大腸桿菌BJ5183內(nèi)與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒DNA。將重組腺病毒DN

12、A經(jīng)PacI酶切線性化后通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)包裝成完整的腺病毒。通過(guò)骨髓細(xì)胞增殖試驗(yàn)和Western-blot可以檢測(cè)到這兩株重組腺病毒(rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1)可以正確表達(dá)目的蛋白。 利用BALB/c小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)，測(cè)定其誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫水平.然后在豚鼠和豬上進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，檢測(cè)了其免疫保護(hù)力，結(jié)果表明，免疫串聯(lián)表達(dá)融合蛋白GMCSF-VPe的重組腺病毒rA

13、d-GMCSF-VPe的小鼠產(chǎn)生了最高水平的FMDV特異性的T淋巴細(xì)胞增殖、IFN-γ和IL-4；免疫串聯(lián)表達(dá)融合蛋白GMCSF-VP1的重組腺病毒rAd-GMCSF-VP1的小鼠產(chǎn)生了最高水平的FMDV特異性的體液免疫應(yīng)答.聯(lián)合應(yīng)用rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1(rAd-GMCSF-VPe+rAd-GMCSF-VP1)免疫豚鼠和豬，兩次免疫后中和抗體水平低于滅活苗免疫組(P<0.05)，但聯(lián)合免疫的所有動(dòng)物均可

14、抵抗FMDV強(qiáng)毒的攻擊.該研究表明，聯(lián)合應(yīng)用重組腺病毒rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1可能成為預(yù)防口蹄疫病毒感染的免疫策略。 綜上所述，F(xiàn)MDV多表位VPe蛋白或VP1蛋白與pIFNα或GMCSF融合表達(dá)后，能明顯提高其誘導(dǎo)的中和抗體水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫rAd-pIFNα-VPe或者聯(lián)合應(yīng)用rAd-GMCSF-VPe和rAd-GMCSF-VP1(rAd-GMCSF-VPe+rAd-GMCSF-VP1)的