siRNA抑制DREAM基因表達治療神經病理性痛的實驗研究.pdf

1、疼痛是一種與實際或潛在組織損傷相關聯的不愉快的感覺和情感體驗，是一種復雜的生理心理活動，是臨床上最常見的癥狀之一，也是促使人們就醫(yī)的最常見原因之一。慢性疼痛不僅僅是一種癥狀，也可以是一種疾病。任何人一生中都難免要遭受疼痛的折磨。全世界有三分之一以上的人正在不同程度地遭受著慢性疼痛的折磨，嚴重影響了工作、學習和生活。疼痛不會導致直接患者死亡，但有些患者因為忍受不了長時間的嚴重慢性疼痛而產生自殺的念頭，甚至采取自殺行為。麻醉性鎮(zhèn)痛藥和非甾體

2、消炎鎮(zhèn)痛藥仍然是目前疼痛治療的最主要藥物，但這些藥物特異性不高，療效并不理想，而且長期使用可以引起藥物依賴、呼吸抑制、胃腸道損傷等嚴重副作用，相當一部分病人不得不停止使用。頑固性癌痛和神經病理性疼痛的治療是臨床醫(yī)師面臨的棘手課題，神經病理性疼痛一般對阿片類藥物不敏感，抗抑郁藥和抗癲癇藥治療神經病理學疼痛的療效不佳。因此，國內外不少學者在不斷地探究疼痛產生的病理生理機制，尋求疼痛治療的新技術和新方法。 轉錄因子下游調控元件的拮抗分

3、子(Downstream regulatoryelement antagonist modulator,DREAM)是痛覺處理過程中關鍵的轉錄抑制子之一，DREAM與前腦啡肽原基因(preprodynorphin，PPD)的DRE(Downstream regulatory element)位點結合，抑制PPD基因表達而發(fā)揮作用。DREAM痛覺調節(jié)作用的發(fā)現為疼痛治療提供了嶄新的研究靶點，我們可以通過阻斷DREAM基因，解除其對PPD基

4、因表達抑制，激活內源性強啡肽/к受體鎮(zhèn)痛系統(tǒng)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)現象的發(fā)現和RNA干擾技術的不斷完善，RNAi已經成為當今生命科學研究領域的研究熱點之一。RNAi具有高度特異性和高效性，并有強大的細胞穿透能力，可在細胞間傳遞，甚至遺傳給子代等特點。RNA干擾是研究生物體基因表達、調控與功能的新技術，是一種快捷高效、特異性強的抑制基因表達的工具。近年來有人將RNAi技術用于疼痛

5、治療實驗研究取得成功。如2004年Dorn等將他們將化學合成的針對P2X3的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)經鞘內注入，顯著減輕了大鼠神經病理性疼痛，不伴有明顯的毒性反應和非特異性反應。提示RNAi技術用于疼痛的基因治療是可行的。 本研究的目的是利用RNA干擾技術抑制DREAM基因表達，開展對神經病理性疼痛基因治療的實驗研究。整個研究分三部分進行，第一部分觀察設計的針對DREAM基因的SiR

6、NA在神經膠質細胞中的RNA干擾效應，確定針對DREAM基因進行RNA干擾的有效作用位點，為后續(xù)的慢病毒載體的構建及體內實驗奠定基礎。利用在線網站的生物軟件設計多個DREAM基因的RNA干擾序列，構建RNA干擾質粒，然后利用脂質體轉染到神經膠質細胞中，通過熒光顯微鏡觀察、Realtime-PCR測定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot測定。DREAM蛋白含量以觀察RNA干擾效應。結果顯示針對示針對DREAM基因設計了3

7、條SiDREAM序列并構建了siRNA表達載體在培養(yǎng)的神經膠質細胞中轉染率為85％，其中siRNA表達載體pRNAT-DREAM-Ⅱ和pRNAT-DREAM-Ⅲ使DREAM基因mRNA分別下調59％和47％，DREAM蛋白的表達亦明顯降低。第二部分是針對DREAM基因有效的RNA干擾作用位點構建能夠在細胞內表達siRNA的慢病毒載體。根據第一部分實驗篩選出的有效的siRNA序列設計合成適當的引物，重組到慢病毒穿梭質粒中，將重組質粒pKC

8、SHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包裝系統(tǒng)共轉染293T細胞包裝出復制缺陷的慢病毒顆粒，并進行載體病毒滴度的測定。結果成功構建了慢病毒質粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM，測序結果與設計的siRNA序列完全一致，將質粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉染293T細胞獲得滴度為1.0×108ifu/ml慢病毒顆粒。第三部分是將攜帶有siDREAM的慢病毒顆粒注入大鼠體內，研究siDREAM的

9、RNA干擾效應，為以后臨床實驗奠定基礎。將純種健康清潔級成年雄性SD大鼠36只，隨機分為6組：正常對照組(N)、假手術組(S)，根據干預手段的不同將CCI疼痛模型組分為4組：CCI組(CO組)，CCI疼痛模型建立后不給任何干預措施，觀察術后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行為學的改變。生理鹽水對照組(C1組)，空白載體對照組(C2組)，pKCSHR-puro/GFP-DREAM治療組(C3組)。該三組大鼠于CCI后第7天分別于蛛

10、網膜下腔注射生理鹽水、空白載體、pKCSHR-puro/GFP-DREAM病毒載體，觀察各組術后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行為學的改變。實驗結束取腰段脊髓進行熒光顯微鏡檢測GFP(綠色熒光蛋白)的表達，Realtime-PCR測定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot測定DREAM蛋白含量以觀察RNA干擾效應。 結果發(fā)現鞘內注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒載體后，CCI大鼠熱痛閾

11、和機械痛閾的異常明顯得到改善，腰段脊髓神經細胞DREAM基因mRNA和DREAM蛋白的表達均顯著降低(P<0.05)。 本研究所得到的結論如下： 1.成功構建了針對DREAM基因特異性siRNA表達載體，在體外培養(yǎng)的神經膠質細胞中產生針對DREAM基因特異性的RNA干擾效應，并確定了最佳作用位點為536～555。 2.成功構建了表達siDREAM的慢病毒質粒載體一pKCSHR-Puro/GFP-DREAM，并與慢

12、病毒包裝系統(tǒng)共轉染293T細胞，獲得了滴度高達1.0 X 108 ifu/ml慢病毒顆粒。 3.鞘內注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒顆粒可高效轉染到大鼠脊髓神經細胞內，能夠有效改善CCI大鼠痛覺異常，初步證實具有鎮(zhèn)痛效應，為疼痛的基因治療提供了新的思路。 4.鞘內注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒顆粒可使大鼠腰段脊髓內DREAM基因mRNA表達下調，DREAM蛋白表達降低，提示pKC