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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究在2006-2007年從山東省分離到10株腎型IBV,并通過電鏡形態(tài)觀察、致雞胚矮小化試驗(yàn)、病毒干擾試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)以及分子生物學(xué)試驗(yàn)等方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定,同時(shí)對(duì)病毒基因組中的核蛋白基因序列進(jìn)行了測(cè)定、分析和比較,以說明山東省腎型IBV毒株之間以及與參考毒株之間基因的遺傳變異情況,同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析山東省腎型IBV分離株與參考株之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,探討山東省腎型IB流行的背景和原因。 現(xiàn)地瀕死病雞病變組織
2、處理后接種9~11日齡SPF雞胚,接種雞胚后72h內(nèi)收集尿囊液,同時(shí)觀察胚體病變。傳3~7代后,發(fā)現(xiàn)死亡雞胚表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育障礙(侏儒胚),胚體彌漫性出血,尤其是頭部出血比較明顯,未死亡雞胚呈現(xiàn)典型的卷曲胚。病毒尿囊液對(duì)雞外周血紅細(xì)胞無凝集活性。病毒尿囊液在電鏡下表現(xiàn)為病毒粒子大多呈球形,直徑約為80~120nm,有囊膜,表面有松散、均勻排列的冠狀突起,呈現(xiàn)典型的冠狀病毒特征,而且未發(fā)現(xiàn)有其它病毒粒子的存在。病毒干擾試驗(yàn)可見其能明顯干擾N
3、DV在雞胚中的增殖。未經(jīng)任何處理的10株分離株病毒對(duì)10mL/L的雞紅細(xì)胞無血凝活性,而經(jīng)Ⅰ型磷脂酶C處理后10株分離株病毒對(duì)雞紅細(xì)胞具有血凝活性。從10株分離病毒的SPF雞胚尿囊液中提取病毒RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物電泳,均獲得了1600bp左右的核酸片段,與當(dāng)初設(shè)計(jì)引物所要擴(kuò)增的IBV基因片段大小一致,所以可以斷定本研究所分離的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒?;貧w動(dòng)物后,均表現(xiàn)為腎腫脹、有尿酸鹽沉積,形成“花斑腎”,因而確認(rèn)從山
4、東省分離到的這10株病毒為腎型IBV。 應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)從山東省分離鑒定到2006-2007年間的10株腎型IBV核蛋白基因序列進(jìn)行了克隆、測(cè)定及分析,結(jié)果表明,這些毒株核蛋白基因的核苷酸序列由1230bp組成,編碼由409個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,與Beaudette株相應(yīng)區(qū)域基因序列長(zhǎng)度一致。10株腎型IBV分離毒株之間相比,N基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為84.6%~99.7%和86.6%~99.8%,與參考毒株
5、N基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為84.1%~98.9%和86.1%~98.5%。進(jìn)行序列比較后發(fā)現(xiàn),山東省大部分腎型IBV分離株的核蛋白基因的核苷酸序列存在廣泛的基因突變現(xiàn)象,這可能是造成山東省腎型IBV分離株基因組發(fā)生變異的主要原因之一。 根據(jù)本研究從山東省分離鑒定到2006-2007年間的10株腎型IBV病毒與我國(guó)其他IBV分離株、我國(guó)常用疫苗株以及國(guó)外參考毒株繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),從山東省分離到10株腎型IBV具有兩
6、個(gè)大的基因進(jìn)化群。SD0605和SD0608屬于基因Ⅰ型,其中主要是Mass血清型毒株,包括美國(guó)、荷蘭、澳大利亞、日本等國(guó)家的IBV代表性毒株以及國(guó)內(nèi)的。腎型IBV代表毒株。SD0605N基因與中國(guó)廣東IBV腎型疫苗株D41以及H120同源性最高,核苷酸及推導(dǎo)氨基酸同源性均分別為98.9%和98.5%;SD0608N基因與中國(guó)廣西腎型毒株GX2的同源性最高,核苷酸及推導(dǎo)氨基酸同源性分別為94.9%和95.6%。這提示SD0605和SD0
7、608的存在可能與山東省長(zhǎng)期使用弱毒疫苗有關(guān),存在基因重組現(xiàn)象。其余的八株分離株病毒屬于基因Ⅱ型,其中主要是廣東腎型IBV毒株GDS14和新疆腎型IBV毒株LX4,以及山東的IBV分離株QXIBV,與我國(guó)常用弱毒疫苗株如H120、H52等關(guān)系較遠(yuǎn)。以上結(jié)果說明山東省腎型IBV毒株與我國(guó)其他地方的腎型IBV毒株關(guān)系比較近,現(xiàn)有的疫苗可以對(duì)部分毒株起到一定的預(yù)防作用,但對(duì)于SD0702這種變異如此大的毒株可能很難有效預(yù)防,有必要繼續(xù)跟蹤研究
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