銀杏內(nèi)酯B自微乳的研制及拮抗視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性性疾病是一類主要的致盲性眼病，到目前為止發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，因此缺乏理想的治療措施。研究表明光感受器細(xì)胞凋亡是它們共同的病理通路。 銀杏內(nèi)酯B是銀杏葉提取物中的有效成分，具有神經(jīng)元保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡的作用，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病和缺血缺氧病變中的作用已經(jīng)得到公認(rèn)。但是由于難溶于水，體內(nèi)生物利用度低，限制了其在臨床的應(yīng)用，目前國內(nèi)、外都沒有成品藥物上市。本課題研制銀杏內(nèi)酯B的自微乳化釋藥系統(tǒng)，以期提高它的生物利用度，

2、進(jìn)而提高其在視網(wǎng)膜中的藥物濃度：同時(shí)建立MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡模型，探討銀杏內(nèi)酯B自微乳制劑對(duì)感光細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為視網(wǎng)膜變性性疾病提供有效的治療途徑，并進(jìn)一步促進(jìn)中藥現(xiàn)代化。 本研究共分為三部分： 第一部分銀杏內(nèi)酯B拮抗體外培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用 目的：探討銀杏內(nèi)酯B(ginkgolideB，GB)對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的拮抗作用及可能的機(jī)制。

3、 方法：采用酶消化法原代培養(yǎng)SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，建立合適的谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型。MTT法檢測(cè)不同濃度的銀杏內(nèi)酯B對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響。流式細(xì)胞儀聯(lián)合AnnexinV/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞儀聯(lián)合JC-1檢測(cè)線粒體膜電位變化。 結(jié)果：100μM谷氨酸作用12h后，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活率降低至58％，細(xì)胞凋亡率達(dá)到52.4％，JC-1檢測(cè)的紅/綠比值下降。預(yù)先給予不同濃度(10-100μM

4、)的銀杏內(nèi)酯B后，神經(jīng)細(xì)胞存活率增加，凋亡率降低，線粒體膜電位提高。在10-100μM范圍內(nèi)其作用有劑量依賴性。 結(jié)論：銀杏內(nèi)酯B可以劑量依賴性的拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與提高線粒體膜電位有關(guān)。 第二部分銀杏內(nèi)酯B自微乳化釋藥系統(tǒng)的處方研究和在SD大鼠視網(wǎng)膜分布的藥代動(dòng)力學(xué)研究 目的：制備銀杏內(nèi)酯B白微乳化制劑(self-microemulsifyingdrugdeliverysyst

5、ems，SMEDDS)并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，同時(shí)考察口服后SD大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。 方法：通過高效液相-電噴霧-質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)方法測(cè)定銀杏內(nèi)酯B在不同油相、表面活性劑、助表面活性劑中的溶解度，結(jié)合偽三元相圖，篩選銀杏內(nèi)酯B自微乳化制劑的處方?？疾焖幬锖亢头稚⒔橘|(zhì)對(duì)制劑穩(wěn)定性的影響，考察該制劑經(jīng)0.1NHCI稀釋后形成微乳的形態(tài)、粒徑和成乳穩(wěn)定性。以普通銀杏內(nèi)酯B混懸液為對(duì)照，觀察口服40mg/kg銀杏內(nèi)

6、酯B自微乳化制劑后SD大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。 結(jié)果：自微乳化介質(zhì)處方為油酸乙酯-(CremophorEL/大豆磷脂/無水乙醇)(40:60，w/w)，其中CremophorEL/大豆磷脂/無水乙醇(4:1:2)，GB的載藥量為2.5％。乳化介質(zhì)(H2O和0.1NHCl)對(duì)制劑自微乳化效率影響不大。銀杏內(nèi)酯B自微乳制劑經(jīng)0.1NHCl稀釋100倍后透射電鏡下呈圓球形，分布均勻，粒徑為41.6±1.11nm，自微乳化時(shí)間大約在

7、2分鐘。8h內(nèi)制劑穩(wěn)定，粒徑變化不大，無藥物析出。SD大鼠分別口服40mg/kgGB-SMEDDS和等量GB混懸液后，峰濃度(Cmax)分別為15.83±1.84ng/ml和2.65±0.10ng/ml，藥物濃度曲線下面積(AUC0-∞)分別為15.30±0.11ng/mg.h和6.42±0.19ng/mg.h。 結(jié)論：銀杏內(nèi)酯B自微乳化制劑制備簡單，質(zhì)量穩(wěn)定，可以顯著提高藥物在SD大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的含量。 第三部分銀杏內(nèi)酯

8、B自微乳化給藥系統(tǒng)拮抗MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究 目的：探討銀杏內(nèi)酯B自微乳化制劑對(duì)N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的治療作用及可能的作用機(jī)制。 方法：生后45天的SD大鼠105只，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量GB治療組(40mg/kg)、中劑量GB治療組(80mg/kg)、高劑量GB治療組(120mg/kg)。GB治療組于生后

9、45天開始用GB-SMEDDS灌胃給藥，模型對(duì)照組給等量生理鹽水灌胃，每日三次，連續(xù)灌服6日。模型組和GB治療組于生后第50天一次性腹腔注射MNU40mg/kg，建立大鼠視網(wǎng)膜變性模型。各組每次5只分別于腹腔注射MNU后24h、48h、3d、5d、7d做視網(wǎng)膜電圖，繼而處死動(dòng)物，各組取右眼球做病理切片，測(cè)量中心視網(wǎng)膜外層厚度(外核層和光感受器細(xì)胞層)；TUNEL法檢測(cè)光感受器細(xì)胞凋亡。正常對(duì)照組、模型組和低劑量GB治療組分別取左眼視網(wǎng)膜

10、提取RNA，RF-PCR檢測(cè)各組Bcl-xl和Bax表達(dá)量變化。 結(jié)果：模型組注射MNU后F-ERGa、b波振幅明顯下降，第3天時(shí)呈熄滅型。給予不同劑量的GB-SMEDDS灌胃后a、b波振幅均比同時(shí)間點(diǎn)的模型組高(P<0.05)；建模后7天，治療組間ERGa、b波振幅相互比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。治療組中心視網(wǎng)膜外層厚度與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組相比明顯增厚(P<0.05)。到建模第七天時(shí)，各治療組間視網(wǎng)膜外層厚度相互比較有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)差異(P<0.05)：給予GB-SMEDDS治療后，TUNEL檢查細(xì)胞凋亡指數(shù)與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組相比明顯減少(P<0.05)。MNU腹腔注射后1dRT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中Bcl-xlmRNA的表達(dá)迅速降低，到第3d降至最低，此后逐漸上升但是仍低于正常對(duì)照；而BaxmRNA的表達(dá)量在1d時(shí)達(dá)到高峰，此后表達(dá)量下降，但是總體趨勢(shì)仍高于正常；Bcl-xl/Bax比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常對(duì)照組。GB-SMEDDS治療組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Bel-xl的表