Gremlin在馬兜鈴酸誘導腎小管上皮細胞轉分化中的作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　 1993年比利時學者首次報道服用含馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)的中草藥導致進行性腎小管間質纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis，RIF)，最終引起腎功能衰竭，后被稱為馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)。研究表明AA主要導致腎小管間質纖維化、慢性腎功能損傷和泌尿系統(tǒng)移行上皮腫瘤，其發(fā)病機制不是很清楚。我

2、們前期實驗研究發(fā)現骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7，BMP-7)能有效的逆轉AA誘導的人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cells，HK-2)轉分化(epithelial-to-mesenchymal transition)，但BMP-7在AAN中調控機制仍不清楚。Gremlin，作為BMP-7拮抗劑，在AA誘導HK-2形成EMT中是否調節(jié)BMP-

3、7的腎損傷修復的作用尚不清楚。因此，進一步揭示gremlin在AA誘導HK-2形成EMT中的作用，對探討AAN發(fā)病機制和制定新的防止措施具有重要意義。
　　 本課題通過建立AAN體外模型，觀察gremlin、BMP-7和P-Smad1/5/8的表達變化，探討gremlin是否調節(jié)BMP-7的腎臟保護作用，闡明gremlin在AAN中的作用機制，為AAN的防治尋找新的方向。
　　 方法：
　　 本課題分為2部分進行

4、探討。
　　 第一部分：觀察AA誘導HK-2形成EMT時gremlin、BMP-7及其胞內信號傳遞(P-Smad1/5/8水平)的表達。
　　 1、用MTT方法篩選出AA既能誘導EMT又不影響細胞活力的最適濃度。
　　 2、以此濃度作用HK-2細胞0h，24h，48h，72h，分別用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。用RT-PCR方法檢測gremlin、BMP-7 mRNA的表達，Western blot方法檢測

5、gremlin、BMP-7和P-Smad1/5/8蛋白水平。用免疫熒光染色檢測EMT相關標記分子α-SMA和E-cadherin的表達。
　　 第二部分：Gremlin基因沉默對AA誘導的HK-2 EMT和BMP-7及其信號傳遞的影響
　　 1、根據人Gremlin mRNA基因編碼區(qū)序列，利用計算機軟件設計正對Gremlin的3對siRNA寡聚單鏈DNA，siRNAs(siRNA-Gremlin-1，si RNA-Gr

6、emlin-2，siRNA-Gremlin-3)，和一條作為陰性對照的無關序列(siRNA-Gremlin-neg)。將上述siRNA分別插入到siRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPsiR中，構建3種特異性siRNA的質粒(pshRNA-Gremlin-1，pshRNA-Gremlin-2，pshRNA-Gremlin-3)和1種表達無關序列的質粒pshRNA-Gremlin-neg。
　　 2、分別以脂質體L

7、ipofectamineTM2000為介導，將重組質粒轉入HK-2細胞，用空白質粒載體做為空白對照。實驗分組如下：1)正常對照組：細胞在DMEM/F12完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。2)AA組：細胞在含AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3)：AA+Gremlin control siRNA：細胞轉染pshRNA-Gremlin-neg后培養(yǎng)于AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4)：AA+Gremlin siRNA組：細胞轉染

8、pshRNA-Gremlin-3后培養(yǎng)于AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
　　 3、用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)，收集各組細胞RT-PCR檢測gremlin和BMP-7的mRNA水平，Western blot檢測gremlin、BMP-7、P-Smad1/5/8、α-SMA、E-cadherin和Ⅰ型膠原蛋白的蛋白水平，免疫熒光染色檢測EMT相關標記分子α-SMA和E-cadherin的表達。
　　 結

9、果：
　　 第一部分：
　　 1、AA可誘導HK-2發(fā)生EMT，隨著AA誘導時間的延長細胞EMT形態(tài)變化越明顯。AA誘導EMT的最適濃度是10μmol/L。
　　 2、AA(10μmol/L)可增加HK-2α-SMA表達，減少E-cadherin表達，并呈時間依賴性。
　　 3、HK-2與(10μmol/L)AA孵育后，gremlin mRNA和蛋白水平24h即表現升高，72h達最高。同時，BMP-7和P

10、-Smad1/5/8表達水平逐漸下降，呈時間依賴性。
　　 第二部分：
　　 1：轉染gremlin siRNA能顯著抑制AA誘導HK-2細胞的gremlin的表達，提高P-Smad1/5/8的蛋白水平，但BMP-7的表達水平無變化。
　　 2：轉染gremlin siRNA能顯著降低AA誘導HK-2細胞的α-SMA和Ⅰ型膠原的表達，增加E-cadherin的表達，抑制EMT，促進細胞的形態(tài)恢復。
　　

11、結論：
　　 1、AA可增加HK-2合成gremlin，減少BMP-7的表達和降低P-Smad1/5/8水平，提示gremlin/BMP-7失衡可能參與AA誘導的EMT。
　　 2、Gremlin基因沉默可顯著恢復P-Smad1/5/8水平，但對BMP-7表達無影響，說明gremlin高表達介導的BMP-7活性下降可能是AA誘導HK-2 EMT發(fā)生的機制之一。
　　 3、Gremlin基因沉默可顯著抑制EMT，促