2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景和目的:
   1993年比利時學者首次報道服用含馬兜鈴酸(aristolochic acid,AA)的中草藥導致進行性腎小管間質纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis,RIF),最終引起腎功能衰竭,后被稱為馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy,AAN)。研究表明AA主要導致腎小管間質纖維化、慢性腎功能損傷和泌尿系統(tǒng)移行上皮腫瘤,其發(fā)病機制不是很清楚。我

2、們前期實驗研究發(fā)現骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,BMP-7)能有效的逆轉AA誘導的人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)轉分化(epithelial-to-mesenchymal transition),但BMP-7在AAN中調控機制仍不清楚。Gremlin,作為BMP-7拮抗劑,在AA誘導HK-2形成EMT中是否調節(jié)BMP-

3、7的腎損傷修復的作用尚不清楚。因此,進一步揭示gremlin在AA誘導HK-2形成EMT中的作用,對探討AAN發(fā)病機制和制定新的防止措施具有重要意義。
   本課題通過建立AAN體外模型,觀察gremlin、BMP-7和P-Smad1/5/8的表達變化,探討gremlin是否調節(jié)BMP-7的腎臟保護作用,闡明gremlin在AAN中的作用機制,為AAN的防治尋找新的方向。
   方法:
   本課題分為2部分進行

4、探討。
   第一部分:觀察AA誘導HK-2形成EMT時gremlin、BMP-7及其胞內信號傳遞(P-Smad1/5/8水平)的表達。
   1、用MTT方法篩選出AA既能誘導EMT又不影響細胞活力的最適濃度。
   2、以此濃度作用HK-2細胞0h,24h,48h,72h,分別用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。用RT-PCR方法檢測gremlin、BMP-7 mRNA的表達,Western blot方法檢測

5、gremlin、BMP-7和P-Smad1/5/8蛋白水平。用免疫熒光染色檢測EMT相關標記分子α-SMA和E-cadherin的表達。
   第二部分:Gremlin基因沉默對AA誘導的HK-2 EMT和BMP-7及其信號傳遞的影響
   1、根據人Gremlin mRNA基因編碼區(qū)序列,利用計算機軟件設計正對Gremlin的3對siRNA寡聚單鏈DNA,siRNAs(siRNA-Gremlin-1,si RNA-Gr

6、emlin-2,siRNA-Gremlin-3),和一條作為陰性對照的無關序列(siRNA-Gremlin-neg)。將上述siRNA分別插入到siRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPsiR中,構建3種特異性siRNA的質粒(pshRNA-Gremlin-1,pshRNA-Gremlin-2,pshRNA-Gremlin-3)和1種表達無關序列的質粒pshRNA-Gremlin-neg。
   2、分別以脂質體L

7、ipofectamineTM2000為介導,將重組質粒轉入HK-2細胞,用空白質粒載體做為空白對照。實驗分組如下:1)正常對照組:細胞在DMEM/F12完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。2)AA組:細胞在含AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3):AA+Gremlin control siRNA:細胞轉染pshRNA-Gremlin-neg后培養(yǎng)于AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4):AA+Gremlin siRNA組:細胞轉染

8、pshRNA-Gremlin-3后培養(yǎng)于AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
   3、用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài),收集各組細胞RT-PCR檢測gremlin和BMP-7的mRNA水平,Western blot檢測gremlin、BMP-7、P-Smad1/5/8、α-SMA、E-cadherin和Ⅰ型膠原蛋白的蛋白水平,免疫熒光染色檢測EMT相關標記分子α-SMA和E-cadherin的表達。
   結

9、果:
   第一部分:
   1、AA可誘導HK-2發(fā)生EMT,隨著AA誘導時間的延長細胞EMT形態(tài)變化越明顯。AA誘導EMT的最適濃度是10μmol/L。
   2、AA(10μmol/L)可增加HK-2α-SMA表達,減少E-cadherin表達,并呈時間依賴性。
   3、HK-2與(10μmol/L)AA孵育后,gremlin mRNA和蛋白水平24h即表現升高,72h達最高。同時,BMP-7和P

10、-Smad1/5/8表達水平逐漸下降,呈時間依賴性。
   第二部分:
   1:轉染gremlin siRNA能顯著抑制AA誘導HK-2細胞的gremlin的表達,提高P-Smad1/5/8的蛋白水平,但BMP-7的表達水平無變化。
   2:轉染gremlin siRNA能顯著降低AA誘導HK-2細胞的α-SMA和Ⅰ型膠原的表達,增加E-cadherin的表達,抑制EMT,促進細胞的形態(tài)恢復。
  

11、結論:
   1、AA可增加HK-2合成gremlin,減少BMP-7的表達和降低P-Smad1/5/8水平,提示gremlin/BMP-7失衡可能參與AA誘導的EMT。
   2、Gremlin基因沉默可顯著恢復P-Smad1/5/8水平,但對BMP-7表達無影響,說明gremlin高表達介導的BMP-7活性下降可能是AA誘導HK-2 EMT發(fā)生的機制之一。
   3、Gremlin基因沉默可顯著抑制EMT,促

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