晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導人近端腎小管上皮細胞肥大及間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的機制研究.pdf

1、目的：在這項研究中，觀察AOPPs刺激是否引起HK-2細胞（人近端腎小管上皮細胞株）的CTGF表達增加，及進一步探討CTGF是否參與AOPPs誘導的HK-2細胞肥大和轉(zhuǎn)分化。此外，JNK信號通路在此過程中的作用。
　　方法：1、AOPPs-BSA的制備及含量測定
　　將牛血清白蛋白(BSA，100 mg/mL)與次氯酸溶液（HOCl，200 mmol/L）等體積混合，室溫下反應30min，用PBS透析24小時以去除殘余的次氯

2、酸。制備的AOPPs樣品通過Detoxi-Gel凝膠柱消除污染類毒素。所得AOPPs樣品內(nèi)毒素的水平經(jīng)動態(tài)內(nèi)毒素檢測試劑盒（Sigma公司）評估低于0.025EU/ml。
　　2、HK-2細胞的培養(yǎng)
　　HK-2細胞購自美國ATCC細胞庫，使用DMEM/F12培養(yǎng)液（含10％熱滅活的胎牛血清、100μ g/mL濃度的鏈霉素、100 U/mL濃度的青霉素）進行培養(yǎng)，放置于含5％二氧化碳、37℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3、
　　3、siRNA干擾
　　非特異性siRNA及CTGF的特異性siRNA是購自上海GenePharma公司。siRNA干擾細胞使用Lipofectamine2000細胞轉(zhuǎn)染試劑（購自美國Invitrogen公司）。CTGF的特異性siRNA為CCGACTGGAAGACACGTT。在此實驗中我們使用了非特異性siRNA作為陰性對照。CTGF siRNA的干擾效果通過western-blot測定進行評估。
　　4、RT

4、-PCR
　　按照試劑說明書利用TRIzo試劑（購自Invitrogen公司）提取細胞總RNA。用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR進行使用PCR擴增儀和SYBR Green熒光染料(TaKaRa，Japan)。RT-PCR的定量遵循以下反應條件:95℃預變性2min，95℃變性30s，60℃退火35s，共設(shè)置40個循環(huán)。所有數(shù)據(jù)都使用內(nèi)參β-actin規(guī)范化，使用2-DDCt方法分析

5、基因的表達水平。
　　5、Western-blot檢測(CTGF, E-cadherin, vimentin, JNK, and Phospho-JNK)
　　細胞在RIPA緩沖液里進行溶解，溶解產(chǎn)物使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。然后電轉(zhuǎn)移SDS-PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)。隨后，加入封閉液封閉PVDF膜，放置于搖床上室溫下緩慢搖動2h，加入一抗4℃下緩慢搖動孵育過夜。一抗作用結(jié)束后，PVDF膜用TBST反復漂洗，然后

6、加入稀釋好的辣根過氧化物酶(HRP)標記好的二抗室溫下孵育1h。使用X光片將PVDF膜進行顯影成像并掃描分析。
　　結(jié)果：1、AOPPs誘導HK-2細胞CTGF的表達升高
　　AOPPs處理組CTGF的蛋白及mRNA表達水平均高于對照組，在12小時達到最高峰，持續(xù)至24小時仍顯著高于對照組。
　　2、CTGF參與AOPP引起的HK-2細胞肥大和EMT
　　將CTGF siRNA轉(zhuǎn)染入AOPPs處理的HK-2細胞，

7、可使CTGF蛋白表達水平顯著下降。Western-blot檢測及RT-PCR均顯示:與non-specific siRNA干擾對照組相比，特異性CTGF siRNA轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)AOPPs引起的HK-2細胞鈣粘蛋白的表達抑制和波形蛋白超表達。阻斷CTGF明顯下調(diào)AOPPs誘導的HK-2細胞的肥大指數(shù)。
　　3、CTGF通過JNK信號通路調(diào)節(jié)AOPPs觸發(fā)的HK-2細胞肥大和EMT
　　AOPPs刺激誘導HK-2細胞JNK磷酸化

8、水平升高，這表明AOPPs參與激活HK-2細胞中的JNK信號通路。JNK抑制劑(SP600125)顯著阻礙了AOPPs誘導的JNK磷酸化。同時，JNK抑制劑顯著地抑制AOPPs引起的HK-2細胞鈣粘蛋白表達減少和CTGF、波形纖維蛋白在mRNA及蛋白水平的表達升高。此外，AOPPs誘導的HK-2細胞的肥大指數(shù)也被SP600125顯著抑制。
　　結(jié)論：1、本實驗再次證實AOPPs可誘導人近端腎小管上皮細胞肥大和EMT;
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