磷酸化蛋白在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1致人腎小管上皮細(xì)胞損傷中的研究.pdf

1、腎纖維化是慢性腎臟病(CKD)發(fā)展至終末期的最終結(jié)果，其病理特征包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是目前公認(rèn)促纖維化細(xì)胞因子之一，阻斷TGF-β通路對(duì)延緩疾病進(jìn)展具有重要意義。但因TGF-β有諸多生理功能，故針對(duì)TGF-β治療策略應(yīng)側(cè)重于其下游細(xì)胞因子并探尋新的治療靶點(diǎn)。蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，如磷酸化、泛素化、乙?；刃揎椩谡{(diào)控細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞功能中起重要作用，同時(shí)蛋白磷酸化修飾在TGF-β信號(hào)通路中地位舉

2、足輕重。本研究聚焦于TGF-β及相關(guān)信號(hào)通路中磷酸化蛋白作用機(jī)制，為深入探討TGF-β信號(hào)通路提供研究基礎(chǔ)。主要內(nèi)容如下： 第一部分，利用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)簽試劑(isobaric tags forrelative and absolute quantiration，iTRAQ)對(duì)入腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)總蛋白進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜分析標(biāo)記結(jié)果。結(jié)果提示iTRAQ試劑能成功對(duì)HK-2細(xì)胞蛋白進(jìn)行標(biāo)記，且標(biāo)記效率及重復(fù)

3、性較好，為進(jìn)一步研究提供了技術(shù)平臺(tái)。 第二部分，利用已成功建立的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)iTRAQ-2D-mano-HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞損傷過(guò)程中磷酸化蛋白進(jìn)行標(biāo)記鑒定。通過(guò)ProteinPilot軟件分析，鑒定出差異表達(dá)蛋白38個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)磷酸化蛋白19個(gè)，表達(dá)下調(diào)磷酸化蛋白19個(gè)；通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)表達(dá)上調(diào)的磷酸化蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、功能分類以及蛋白交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分

4、析處理；并對(duì)其中兩個(gè)差異表達(dá)磷酸化蛋白(磷酸化HSP900α和磷酸化moesin)通過(guò)western blot以驗(yàn)證差異表達(dá)。 第三部分，對(duì)磷酸化moesin及與moesin具有高度同源性、同屬ezrin/radixin/moesin(ERM)蛋白家族的radixin和ezrin蛋白進(jìn)行研究。結(jié)果表明，moesin、ezrin、radixin在亞細(xì)胞定位上與細(xì)胞骨架高度重疊；TGF-β1可以時(shí)間和濃度依賴方式上調(diào)磷酸化moesi

5、n/ezrin/radixin表達(dá)，且上述作用與TGF-β1選擇性激活Erk1/2信號(hào)通路有關(guān)，阻斷Erk1/2信號(hào)通路可阻斷TGF-β1對(duì)moesin/ezrin/radixin蛋白磷酸化。 第四部分，對(duì)BMP-7和TGF-β1信號(hào)通路中磷酸化蛋白表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，BMP-7和TGF-β1可選擇性激活不同Smad和MAPK信號(hào)通路，即BMP-7可選擇性激活p38-MAPK和Smad5使其磷酸化，而TGF-β1可選擇性激活