超聲微泡介導(dǎo)反義磷酸受納蛋白基因轉(zhuǎn)染效應(yīng)的研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分超聲微泡增加心肌血管通透性并提高基因轉(zhuǎn)染效率 研究背景： 近幾十年來，心臟病的診治方法有了長足的發(fā)展，但是心血管病仍然是人類死亡的主要原因之一?；蛑委熥鳛橐环N新的治療手段正處于探索階段?；蛑委熌芊癯晒Σ粌H取決于作用靶點的正確選擇，而且與載體以及傳輸系統(tǒng)是否奏效密切相關(guān)。直接心肌注射、心腔內(nèi)注射或經(jīng)冠狀動脈傳輸基因都是常用的向心肌輸送外源性基因的方法，但是它們或者需要開胸，或

2、者需要短暫心臟停搏，或者需要結(jié)扎主動脈和肺動脈，有一定的創(chuàng)傷性。 超聲波的“聲致孔”效應(yīng)近年來被證實有利于基因的轉(zhuǎn)染。細胞膜在超聲的作用下可出現(xiàn)一過性的小孔，稱為聲致孔(sonoporation)效應(yīng)，這些小孔可作為藥物或基因進入細胞內(nèi)的通道，而該效應(yīng)在微泡的參與下得到加強。內(nèi)含氣體的微泡從靜脈注射提供了理想的空化核，使超聲介導(dǎo)的基因傳輸有了更廣闊的發(fā)展空間。 目的： 本研究用超聲破裂白蛋白氟碳氣體微泡，以伊文思

3、藍為指示劑，研究增加心肌毛細血管通透性的優(yōu)化超聲參數(shù)，并應(yīng)用該參數(shù)介導(dǎo)報告基因在心肌的轉(zhuǎn)染，觀察超聲破裂微泡增強報告基因轉(zhuǎn)染效率的能力，為治療性基因在心肌的轉(zhuǎn)染提供實驗基礎(chǔ)。 方法： 構(gòu)建含氟碳氣體的白蛋白微泡，從小鼠尾靜脈注射伊文思藍—微泡混合液，研究目前已知的影響微泡破裂的參數(shù)對伊文思藍滲出至心肌組織間隙的影響，包括超聲探頭頻率和機械指數(shù)，選擇伊文思藍滲出最明顯的組合進行報告基因pAAV—LacZ在心肌的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后

4、進行X—gal染色和β—半乳糖苷酶活性定量，評價該基因在心肌的轉(zhuǎn)染效果，并初步觀察對小鼠心臟功能的影響以及在其他臟器的轉(zhuǎn)染情況。 結(jié)果： 1．可引起伊文思藍滲出明顯增加的超聲參數(shù)組合為S3探頭，1.3MHz，MI1.6，應(yīng)用每8個心動周期觸發(fā)。聯(lián)合微泡注射，伊文思藍滲出可較單純注射伊文思藍組增加(251.59±16.4比30.87±4.26，p＜0.05)，達8.15倍。組織切片觀察未見紅細胞滲出。 2．以該超聲

5、參數(shù)設(shè)置聯(lián)合微泡注射進行的報告基因轉(zhuǎn)染顯示，注射第10天，X—gal染色顯示心肌細胞胞漿內(nèi)有β—半乳糖苷酶表達，定量檢測較單純基因注射組明顯增加，達6.56倍，亦明顯高于基因注射加超聲但不合微泡組。第20天時心肌內(nèi)不能檢測到β—半乳糖苷酶表達。 3．肝臟、肺、腦均未見β—半乳糖苷酶表達，僅腎臟腎小管上皮細胞內(nèi)可見β—半乳糖苷酶表達，定量檢測顯示超聲破裂微泡組與對照組無明顯差別，提示為腎臟內(nèi)源性β—半乳糖苷酶。 4．報告基

6、因注射第10天、第20天超聲心動圖檢查未見小鼠心臟收縮功能改變。 結(jié)論： 1．超聲破裂微泡在合適的超聲參數(shù)下能明顯增強心肌毛細血管通透性。 2．采用S3探頭，MI1.6，每8個心動周期觸發(fā)的方式在增加心肌毛細血管通透性的同時，不影響健康大鼠的心臟收縮功能，不引起紅細胞的滲出。 3．經(jīng)靜脈注射的方法通過靶向超聲破裂微泡能使報告基因在心臟成功轉(zhuǎn)染，且基因轉(zhuǎn)染具有器官特異性。 第二部分超聲微泡介導(dǎo)反義磷

7、酸受納蛋白基因轉(zhuǎn)染效應(yīng)的研究 研究背景： 磷酸受納蛋白(PLB)是心肌細胞肌漿網(wǎng)鈣ATP酶(SERCA2a)活性的最重要的調(diào)控蛋白。而PLB絲氨酸16(Ser16)殘基的磷酸化下調(diào)是SERCA2a活性下降的重要原因。體內(nèi)和體外的研究已證實，抑制PLB蛋白的表達，提高PLB的磷酸化水平，能提高SERCA2a的活性，從而改善心臟的收縮和舒張功能。 反義PLB(asPLB)轉(zhuǎn)染心肌細胞能有效抑制細胞內(nèi)PLB的表達，增強

8、SERCA活性，因而改善心肌梗死大鼠的心臟收縮功能。但是外源性基因?qū)牖铙w心肌的常用方法是直接心肌注射或心腔注射，這對于心力衰竭病人無疑有極大的風(fēng)險。超聲破裂微泡進行靶向基因轉(zhuǎn)染作為一種無創(chuàng)的手段正處于研究階段。超聲微泡作為空化內(nèi)核聚焦了超聲能量，降低了聲致孔效應(yīng)的閾值，使細胞膜或毛細血管壁通透性增加，從而讓生物活性大分子物質(zhì)能較容易地進入細胞或組織間隙，因而有利于外源性基因的成功轉(zhuǎn)染。 目的： 本研究以超聲破裂微泡介導(dǎo)

9、asPLB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染急性心肌梗死小鼠，觀察該方法對急性心肌梗死小鼠心肌PLB、Ser16—PLB和SRECA蛋白水平以及SERCA活性和左室收縮功能的影響，為心力衰竭基因治療提供一項實驗依據(jù)。 方法： 構(gòu)建含pAAV—asPLB質(zhì)粒的氟碳氣體白蛋白微泡，以結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法制備急性心肌梗死(MI)小鼠模型。以編碼β—半乳糖苷酶的pAAV—LacZ為報告基因指示轉(zhuǎn)染是否成功。MI小鼠隨機分組為只注射生理鹽水的MI+生

10、理鹽水組(MI+saline)；只注射LacZ質(zhì)粒的MI+LacZ組；注射LacZ質(zhì)粒和進行超聲照射的MI+LacZ+US組；注射LacZ質(zhì)?！⑴莼旌弦?，同時進行超聲照射的MI+lacZ+MB+US組；只注射asPLB質(zhì)粒的MI+asPLB組；注射asPLB質(zhì)粒和超聲照射的MI+asPLB+US組；注射asPLB—微泡混合液，同時進行超聲照射的MI+asPLB+MB+US組。設(shè)立正常對照和假手術(shù)組。術(shù)后經(jīng)尾靜脈進行相應(yīng)的注射和超聲照射

11、。手術(shù)后三周超聲心動圖測定小鼠左室大小和左室短軸縮短率(FS)、左室射血分數(shù)(LVEF)。小鼠處死后，測定左室心肌組織PLB、Ser16—PLB和SERCA蛋白水平及SERCA活性。 結(jié)果： 1．各報告基因注射組，僅MI+LacZ+MB+US組心肌組織有β—半乳糖苷酶表達。肝、肺和腦組織均未見表達，腎小管上皮細胞內(nèi)探及內(nèi)源性β—半乳糖苷酶表達。 2．與假手術(shù)組比，各組MI小鼠心肌SERCA蛋白水平未明顯改變；PL

12、B蛋白水平明顯升高，Ser16—PLB蛋白水平下降；左室內(nèi)徑明顯增大，F(xiàn)S、LVEF明顯下降。除MI+asPLB+MB+US組SERCA活性與假手術(shù)組無明顯差別外，其他各組均下降。 3．與MI+saline組相比，MI+asPLB和MI+asPLB+US組心肌PLB、Ser16—PLB蛋白水平及SERCA蛋白水平和活性均無明顯差別。左室內(nèi)徑及FS、LVEF無明顯改善。 4．與MI+saline相比，MI+aLsPLB+M

13、B+US組左室心肌組織PLB蛋白水平明顯較MI+saline降低(1.45±0.38比2.05±0.31，p＜0.05)，Ser16—PLB水平(0.8±0.25比0.46±0.18，p＜0.05)和SERCA活性(3.00±0.29比2.12±0.30，p＜0.05)明顯較MI+saline升高。SERCA蛋白水平?jīng)]有明顯改變。左室FS(19.6±2.59％比16.0±2.29％，p＜0.05)、LVEF(48.2±5.18％比39.

14、1±5.38％，p＜0.05)上升。 結(jié)論： 1．單純超聲照射不能使靜脈注射的質(zhì)粒在心肌組織有效表達。 2．超聲破裂微泡能增強外源性基因在心肌組織的轉(zhuǎn)染。經(jīng)靜脈注射質(zhì)粒和微泡混合液聯(lián)合胸前區(qū)超聲照射可以達到在心肌靶向性轉(zhuǎn)染的效果。 3．通過超聲破裂微泡技術(shù)，pAAV—asPLB在心肌的轉(zhuǎn)染能部分改善MI小鼠心臟收縮功能，抑制心肌PLB的過表達，提高SERCA活性，增加PLB在Ser16位的磷酸化水平，對S