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文檔簡介
1、目的:構建在哺乳動物細胞中表達Trop2的重組質粒并作用于胃癌BGC823細胞株,探討重組質粒對BGC823細胞株Trop2 mRNA及蛋白的抑制作用,以及對胃癌BGC823細胞遷移侵襲能力的影響。
方法:根據GenBank數據庫提供的Trop2基因核苷酸序列設計三條多聚核苷酸序列,構建三條干擾重組質粒pGenesill.1-Trop21、pGenesill.1-Trop22、pGenesill.1-Trop23;在脂質體
2、的介導下瞬時轉染入人胃癌BGC823細胞株,優(yōu)化轉染條件,熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率;用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,QRT-PCR)和Western blot分析Trop2 mRNA及蛋白的表達;Transwell小室實驗測定干擾重組質粒對BGC823細胞株的的遷移侵襲能力的影響。
結果:(1)酶切鑒定和DNA測序分析顯示,Trop2靶向RNA干擾重
3、組質粒構建成功。(2)細胞轉染條件的優(yōu)化及轉染效率的觀察:當所構建重組質粒與脂質體的質量體積比為1:4轉染時,轉染效率最高達75%。(3)QRT-PCR及Western blot的結果:干擾重組質粒均能使胃癌BGC823細胞株中Trop2 mRNA及蛋白的表達下調。pGenesil1.1-Trop21組、pGenesil1.1-Trop22組、pGenesil1.1-Trop23組對Trop2 mRNA抑制率分別為23.9%、23.7%
4、、29.9%,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);Trop2蛋白抑制率達分別為32.8%、25.5%、62.0%,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。篩選得到pGenesil1.1-Trop23作為最佳干擾效果質粒進行后續(xù)實驗。(4)遷移侵襲實驗結果:體外遷移實驗示pGenesil1.1-Trop23作用BGC823細胞株48小時后,穿過Matrigel膜的細胞個數為(43±6)個,與對照組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<
5、0.05)。體外侵襲實驗pGenesil1.1-Trop23作用BGC823胞株48小時后,穿過Matrigel膜的細胞個數為(23±5)個,與對照組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:干擾重組質粒pGenesil1.1-Trop21、pGenesil1.1-Trop22、pGenesil1.1-Trop23均能有效抑制人胃癌BGC823細胞株Trop2 mRNA和蛋白的表達,最佳干擾質粒pGenesil1.1-
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