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文檔簡介
1、目的:運(yùn)用siRNA(小分子干擾RNA)技術(shù)構(gòu)建靶向抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞表面蛋白2(Trop2)基因的重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體,觀察其對肺腺癌H460細(xì)胞的Trop2基因表達(dá)及對肺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。
方法:運(yùn)用siRNA技術(shù)構(gòu)建靶向抑制Trop2基因的重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肺腺癌H460細(xì)胞株,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率;實(shí)驗(yàn)分三組,Ctrl組、rAd5-siCtrl轉(zhuǎn)染組、rAd5-siTrop2組。
2、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western lotting檢測轉(zhuǎn)染后目的基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平,并用Western blotting檢測目的基因被沉默后細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)及p-ERK-1蛋白的表達(dá)情況。分別采用MTT增殖實(shí)驗(yàn)、Transwelld小室實(shí)驗(yàn)檢測各組差異,觀察沉默肺腺癌H460細(xì)胞的Trop2基因表達(dá)對其細(xì)胞增殖及侵襲能力影響。
結(jié)果:靶向抑制Trop2基因的重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建成功,熒
3、光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率達(dá)85％以上。重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體rAd5-siTrop2介導(dǎo)的靶向Trop2 siRNA可以有效下調(diào)目的基因的mRNA及蛋白表達(dá);同時(shí)Cyclin D1及p-ERK-1蛋白的表達(dá)的表達(dá)亦下調(diào)。MTT增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測顯示肺腺癌H460細(xì)胞增殖及侵襲能力明顯降低。
結(jié)論:通過siRNA技術(shù)構(gòu)建的靶向Trop2基因的重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體可以抑制肺腺癌H460細(xì)胞的Trop2的表達(dá)
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