自噬參與壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞損傷及其機(jī)制研究.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：自噬參與壓力誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：觀察自噬是否參與壓力誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞損傷，探討壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞損傷、死亡的機(jī)制。
　　方法：從3月齡大鼠胸腰段椎間盤內(nèi)提取髓核細(xì)胞培養(yǎng)，取第2代大鼠髓核細(xì)胞，1Mpa壓力下培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測(cè)壓力條件下大鼠髓核細(xì)胞活力，透射電鏡觀察壓

2、力條件下髓核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）定量檢測(cè)自噬相關(guān)基因（LC3B,Beclin-1）在壓力條件下的表達(dá)情況，western blot檢測(cè)壓力條件下大鼠髓核細(xì)胞表達(dá)自噬相關(guān)蛋白（LC3B,Beclin-1）表達(dá)情況。
　　結(jié)果：成功培養(yǎng)出大鼠髓核細(xì)胞，1MPa壓力條件下培養(yǎng)髓核細(xì)胞，可見隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞出現(xiàn)衰老及死亡，透射電鏡下觀察可見壓力誘導(dǎo)損傷的大鼠髓核細(xì)胞內(nèi)存在自噬相關(guān)結(jié)

3、構(gòu)，CCK8結(jié)果顯示壓力應(yīng)激可以導(dǎo)致髓核細(xì)胞數(shù)目減少，壓力應(yīng)激早期(12h、24h、36h)實(shí)驗(yàn)組（3-MA組）髓核細(xì)胞存活數(shù)目與對(duì)照組相比明顯減少，P值分別為0.049,0.021、0.002，晚期(48h)3-MA組髓核細(xì)胞存活數(shù)目與對(duì)照組相比明顯增多，P值為0.039。PCR結(jié)果顯示與正常狀態(tài)下細(xì)胞相比，壓力刺激12h、24h、36h、48h可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞表達(dá)自噬相關(guān)基因（LC3B,Beclin-1）與0h相比表達(dá)均明顯增多（P<

4、0.05）。western blot檢測(cè)顯示壓力條件下培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞12h、24h、36h、48h，自噬相關(guān)蛋白（LC3B,Beclin-1）與0h相比表達(dá)明顯增多（P<0.05）。
　　結(jié)論：自噬參與壓力誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞損傷、死亡，壓力應(yīng)激早期自噬可能對(duì)髓核細(xì)胞損傷起保護(hù)作用，晚期可能加速髓核細(xì)胞死亡，此結(jié)果將為壓力誘導(dǎo)椎間盤退行性變防治提供新思路。
　　第二部分：壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬與凋亡關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究
　　目

5、的：探討壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系。
　　方法：從3月齡大鼠胸腰段椎間盤內(nèi)提取髓核細(xì)胞培養(yǎng)，取第2代大鼠髓核細(xì)胞。使用Annexin-V/PI染色檢測(cè)1MPa壓力培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后大鼠髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡情況，使用自噬抑制劑3-MA抑制自噬觀察凋亡情況。同時(shí)大鼠髓核細(xì)胞單丹黃酰尸胺(MDC)染色后使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬空泡結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞內(nèi)存在自噬空泡的細(xì)胞比例，使用凋亡抑制劑Z-VAD-F

6、MK抑制凋亡，觀察髓核細(xì)胞自噬情況。
　　結(jié)果：MDC染色可觀察到細(xì)胞內(nèi)存在自噬空泡結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞性檢測(cè)1MPa壓力培養(yǎng)12h、24h、36h、48h產(chǎn)生自噬空泡細(xì)胞比例分別為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為1.18±0.335，6.93±0.494，21.36±2.621，12.53±2.364,使用自噬抑制劑3-MA后，24h、36h、48h實(shí)驗(yàn)組(3-MA組)與對(duì)照組相比產(chǎn)生自噬空泡的髓核細(xì)胞數(shù)目明顯減少，p值分別為0.004,0.002,

7、0.003。1MPa壓力條件下培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞12h、24h、36h、48h后凋亡率分別為4.93±0.15,14.93±0.25,31.83±0.72,35.46±0.85。使用3-MA抑制自噬后，1MPa壓力培養(yǎng)髓核細(xì)胞12h、24h、36h、48h細(xì)胞凋亡比例均明顯增高, p值分別為0.006,0.019,0.007,0.021；Z-VAD-FMK抑制凋亡，1MPa壓力培養(yǎng)髓核細(xì)胞12h、24h、36h、48h產(chǎn)生自噬空泡的髓核細(xì)

8、胞比例也明顯增高（P<0.05）。
　　結(jié)論：壓力應(yīng)激條件下自噬與凋亡均參與髓核細(xì)胞損傷，且在壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞損傷過(guò)程中自噬與凋亡是緊密相關(guān)的，抑制自噬可以促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡發(fā)生，抑制凋亡可促進(jìn)髓核細(xì)胞自噬發(fā)生。
　　第三部分：壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬機(jī)制研究
　　目的：觀察活性氧(ROS)是否參與壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬，并闡明ROS誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞自噬機(jī)制。
　　方法：1MPa壓力條件下培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞12h、24h、3

9、6h、48h，加入熒光探針H2DCF-DA后激光共聚焦顯微鏡觀察壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞損傷中產(chǎn)生髓核細(xì)胞內(nèi)ROS水平，及使用流式細(xì)胞儀定量分析大鼠髓核細(xì)胞產(chǎn)生ROS細(xì)胞比例。使用自噬抑制劑3-MA抑制自噬后觀察髓核細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況。髓核細(xì)胞培養(yǎng)基中加入活性氧抑制劑NAC，1MPa壓力培養(yǎng)12h、24h、36h、48h，觀察抑制細(xì)胞產(chǎn)生ROS后細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白（LC3B,Beclin-1）表達(dá)情況。western blot檢測(cè)在使用

10、ROS抑制劑NAC情況下PI3K、AKT、pAKT等相關(guān)蛋白表達(dá)情況，并與無(wú)ROS抑制劑NAC干預(yù)情況下這些蛋白表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)加入JNK抑制劑SP600125,抑制JNK信號(hào)通路，觀察JNK、pJNK蛋白表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：1MPa壓力條件下大鼠髓核細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、36h、48h，髓核細(xì)胞內(nèi) ROS水平與對(duì)照組相比均明顯增高（P<0.05），ROS抑制劑NAC可以抑制大鼠髓核細(xì)胞內(nèi)ROS水平。使用自噬抑制劑3

11、-MA抑制自噬后12h、24h、36h、48h實(shí)驗(yàn)組(3-MA組)分別與對(duì)照組比較髓核細(xì)胞內(nèi)ROS水平均明顯增高（P<0.05）。使用ROS抑制劑NAC后，細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白（LC3B,Beclin-1）及PI3K、AKT表達(dá)均逐漸減少（P<0.05），使用JNK抑制劑SP600125后pJNK表達(dá)明顯減少。
　　結(jié)論：ROS參與壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬，自噬可以降低髓核細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而減少ROS對(duì)髓核細(xì)胞損傷。ROS通過(guò)抑制P