Crizotinib誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞保護(hù)性自噬及其機(jī)制研究.pdf

1、Crizotinib是靶向MET、ALK融合基因和ROS1的多靶點(diǎn)受體酪氨酸激酶抑制劑。Crizotinib作為MET抑制劑被研發(fā)，但首先被FDA批準(zhǔn)用于EML4-ALK融合基因陽性的局部進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性肺腺癌的一線治療，并同時(shí)建議用于存在MET基因擴(kuò)增的肺癌患者。然而同大多數(shù)分子靶向治療藥物類似，半數(shù)以上患者在初始治療1年內(nèi)發(fā)生耐藥，其原因包括原發(fā)性及獲得性耐藥突變，多種旁路癌基因的激活等。作為細(xì)胞對外界刺激的一種應(yīng)激性存活機(jī)制，自噬參

2、與了多種腫瘤細(xì)胞的耐藥。常見的抗腫瘤治療如化療、放療、生物靶向治療等均可以引起腫瘤細(xì)胞自噬。Crizotinib能否誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬發(fā)生，從而導(dǎo)致其耐藥尚不清楚。
　　目的:
　　研究Crizotinib對肺癌細(xì)胞自噬水平的影響及自噬在肺癌細(xì)胞耐藥中所起的作用;分析Crizotinib誘導(dǎo)自噬發(fā)生的具體分子機(jī)制;在此基礎(chǔ)上觀察抑制自噬是否增加肺癌細(xì)胞對Crizotinib的敏感性。
　　方法:
　　通過Weste

3、rn blot、免疫熒光、透射電鏡等方法觀察Crizotinib處理后肺癌細(xì)胞SPC-A1、A549、H2228中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況及自噬體的形成;Western blot分析Criztinib處理后肺癌細(xì)胞MET，STAT3，AKT/MTOR，ERK等信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)情況;采用MTS方法檢測通過自噬抑制劑或下調(diào)自噬關(guān)鍵基因Beclin1抑制自噬對Crizotinib抗腫瘤作用的影響;采用流式細(xì)胞儀定量分析藥物處理后細(xì)胞凋亡比率

4、;建立肺癌裸鼠移植瘤模型評估自噬抑制劑對Crizotinib的增敏作用。
　　結(jié)果:
　　Crizotinib能夠抑制多種肺癌細(xì)胞株的活力，用Crizotinib處理表達(dá)MET的SPC-A1細(xì)胞，表達(dá)EML4-ALK的H2228細(xì)胞，和同時(shí)具有MET表達(dá)和KRAS突變的A549細(xì)胞，均可見細(xì)胞自噬水平的上升，表現(xiàn)為LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換增多;免疫熒光顯示LC3Ⅱ puncta增多及電鏡下自噬體的增加等。
　　Crizo

5、tinib能夠抑制MET及其下游STAT3、AKT/MTOR和ERK的磷酸化水平。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Crizotinib誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬主要是通過分階段的抑制胞質(zhì)及胞核中的STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)，胞質(zhì)中STAT3的抑制導(dǎo)致EIF2AK2與其解離，繼而磷酸化EIF2A而誘導(dǎo)自噬增加，而胞核中STAT3的抑制導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄激活的BCL2水平下降，進(jìn)而促進(jìn)自噬水平的持續(xù)增加。
　　體外研究表明使用自噬抑制劑或下調(diào)自噬關(guān)鍵基因Beclin1抑制

6、自噬促進(jìn)Crizotinib對肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。不同濃度的Crizotinib聯(lián)合CQ或3-MA作用于SPC-A1和A549細(xì)胞后對其抑制作用顯著高于Crizotinib單藥組，(p＜0.001)。以shRNA Beclin1轉(zhuǎn)染SPC-A1和A549細(xì)胞，也能夠顯著提高其對Crizotinib的敏感性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明與Crizotinib單藥處理相比，聯(lián)合CQ和3-MA時(shí)，SPC-A1細(xì)胞凋亡率顯著增加(p＜0.05)。

7、
　　裸鼠移植瘤模型表明自噬抑制劑HCQ增加Crizotinib對SPC-A1細(xì)胞移植瘤生長的抑制作用。Crizotinib聯(lián)合HCQ組抑制腫瘤更為明顯，而不顯著增加毒性。
　　結(jié)論:
　　多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑Crizotinib能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞保護(hù)性自噬，其機(jī)制是通過階段性的抑制胞漿和胞核內(nèi)的STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)。抑制自噬促進(jìn)Crizotinib在體內(nèi)外對肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，提高細(xì)胞凋亡率。聯(lián)合自噬抑制劑可以