壞死性凋亡在壓力誘導(dǎo)的髓核細胞損傷中的作用及其相關(guān)機制研究.pdf

1、第一部分壞死性凋亡參與壓力誘導(dǎo)大鼠髓核細胞死亡的研究
　　目的：研究壞死性凋亡是否參與壓力誘導(dǎo)的髓核細胞死亡，分析其發(fā)生的可能性機制，并初步探討其與自噬的相關(guān)性。
　　方法：從大鼠胸腰椎段椎間盤提取并培養(yǎng)、鑒定髓核細胞，其中第2代細胞用于實驗。1.0 Mpa壓力下培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h后，光鏡觀測細胞形態(tài)學(xué)，透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)改變，cell counting kit-8(CCK-8)檢測細胞活性，流式

2、檢測定量propidium dide(PI)染色陽性率，Calcein-AM/PI染色激光共聚焦直觀地觀測細胞的死亡情況，實時定量PCR及Western blot檢測壞死性凋亡關(guān)鍵分子(RIPK1、RIPK3)的基因及蛋白表達變化。通過壞死性凋亡抑制劑 Nec-1、基因干擾(SiRNA-RIPK1, SiRNA-RIPK3)檢測對細胞活性及死亡率的影響，免疫組化檢測正常及退變椎間盤組織RIPK1, RIPK3的蛋白表達差異均引進了本實驗

3、。Nec-1預(yù)處理前后，單丹黃酰尸胺(MDC)染色流式定量自噬空泡細胞的比例，Western blot檢測自噬關(guān)鍵分子（LC3B, Beclin-1）的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：隨著壓力培養(yǎng)時間的延長，光鏡下細胞出現(xiàn)死亡加劇現(xiàn)象，透射電鏡下見細胞呈現(xiàn)壞死樣超微結(jié)構(gòu)改變，CCK-8結(jié)果示細胞活性逐漸下降（p<0.05），流式檢測示細胞死亡率逐漸升高（p<0.01）。Nec-1明顯抑制壓力誘導(dǎo)的細胞死亡、細胞活性下降（p<0.05）及

4、壞死樣超微結(jié)構(gòu)改變。壞死性凋亡關(guān)鍵分子（RIPK1，RIPK3）的蛋白及基因表達先逐漸升高，達峰值后又降低，但各時間點表達均高于對照組0h（p<0.01）。SiRNA-RIPK3降低壓力誘導(dǎo)的細胞死亡，而SiRNA-RIPK1反而加劇壓力誘導(dǎo)的細胞死亡（p<0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，退變椎間盤內(nèi)（RIPK1，RIPK3）蛋白表達水平明顯高于正常椎間盤，與體外實驗結(jié)果一致。此外，Nec-1明顯降低 MDC陽性率及（LC3B, Becl

5、in1）的蛋白表達水平（p<0.01）。
　　結(jié)論：綜合體內(nèi)外實驗結(jié)果，RIPK1/RIPK3可能介導(dǎo)壓力誘導(dǎo)的髓核細胞壞死性凋亡發(fā)生，而 RIPK1在該過程中可能發(fā)揮兩面作用，RIPK1過度表達促進壞死性凋亡發(fā)生，而其適度表達則可能促進細胞生存，自噬可能是壞死性凋亡的下游途徑。此結(jié)果有望為降低壓力誘導(dǎo)的髓核細胞死亡，進而為延緩甚至阻逆椎間盤退行性變提供全新的思路。
　　第二部分線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激與壓力誘導(dǎo)髓核細胞壞死

6、性凋亡的相關(guān)性研究
　　目的：探討壓力誘導(dǎo)的髓核細胞壞死性凋亡與線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激的相關(guān)性，并初步探討RIPK1在其中發(fā)揮的作用。
　　方法：從大鼠胸腰椎段椎間盤提取并培養(yǎng)、鑒定髓核細胞，其中第2代細胞用于實驗。RIPK1激酶抑制劑Nec-1預(yù)處理細胞，在1.0 MPa壓力條件下培養(yǎng)24h、36h后，熒光探針JC-1染色后流式及激光共聚焦檢測線粒體膜電位（mitochondrial transmembrane pote

7、ntial, MTP）變化，MPTP熒光試劑盒檢測線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）改變情況，熒光探針H2DCF-DA染色后流式及激光共聚焦檢測細胞活性氧（ROS）表達水平，透射電鏡檢測線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，熒光酶標儀檢測細胞ATP水平變化。酶標儀檢測脂質(zhì)氧化酶丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化。此外，為驗證 RIPK1與氧化應(yīng)激水平的

8、上下游關(guān)系，抗氧化劑N-acetyl-L-cysteine（NAC）預(yù)處理后，實時定量PCR及Western blot定量RIPK1的基因、蛋白表達水平變化。
　　結(jié)果：壓力作用24h、36h后，線粒體膜電位明顯下降（p<0.01）、膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放明顯增加（p<0.01）、透射電鏡示線粒體嵴消失、呈現(xiàn)大量空泡化、ATP嚴重耗竭（p<0.01），提示線粒體功能嚴重受損，而 Nec-1明顯抑制壓力誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降（p<0.0

9、1）、膜通透性增加（p<0.01）、線粒體空泡化超微結(jié)構(gòu)改變及ATP水平耗竭等（p<0.01）。隨著壓力培養(yǎng)時間的延長，氧化應(yīng)激指標ROS及MDA活性均逐漸升高，抗氧化指標 SOD活性逐漸下降，提示壓力條件下氧化應(yīng)激水平逐漸升高（p<0.01）。Nec-1能明顯降低 ROS、MDA的活性水平，并同時提高 SOD的活性（p<0.01），表明Nec-1降低壓力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平升高。同時，抗氧化劑NAC對壓力誘導(dǎo)的RIPK1蛋白及基因表達水