鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)機(jī)制的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、第一部分鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物的篩選
　　背景和目的:鼻咽癌常是具有中國特色的腫瘤，廣西、廣東、福建等地是鼻咽癌高發(fā)區(qū)，目前放射治療是鼻咽癌主要治療手段。由于鼻咽癌發(fā)病部位隱蔽，臨床癥狀不明顯，診斷時(shí)往往分期已經(jīng)較晚，給后期的治療帶來困難。即使經(jīng)過有效治療，仍然有10-15％左右的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的再程放療，患者的治療及預(yù)后效果均不佳?，F(xiàn)鼻咽癌復(fù)發(fā)的發(fā)病機(jī)制尚未明了，目前大多數(shù)研究認(rèn)為鼻咽癌的放射抗拒是鼻咽癌復(fù)發(fā)的主要原

2、因之一，同時(shí)，目前臨床上仍沒有可用于監(jiān)測(cè)、診斷、治療鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)標(biāo)志物，構(gòu)建鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)譜，為臨床上鼻咽癌復(fù)發(fā)診療做出貢獻(xiàn)。
　　方法:采集鼻咽癌復(fù)發(fā)和正常復(fù)查隨訪組患者的血清進(jìn)行研究，所有患者嚴(yán)格按照入組標(biāo)準(zhǔn)入組。所有患者均為經(jīng)過放射治療后6個(gè)月，診斷為鼻咽癌復(fù)發(fā)或鼻咽癌正常復(fù)查隨訪病人，診斷明確后均在未予任何治療的情況下進(jìn)行采血，采血后靜置離心，收集血清，

3、分裝進(jìn)入-80度冰箱進(jìn)行保存。復(fù)發(fā)患者隨機(jī)抽取20個(gè)標(biāo)本隨機(jī)分入驗(yàn)證A、B兩組（每組10人），正常復(fù)查隨訪患者隨機(jī)抽取20個(gè)隨機(jī)分入驗(yàn)證A、B兩組（每組10人），復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組進(jìn)行兩兩比較形成A、B兩組，經(jīng)提取蛋白和胰酶消化后，進(jìn)行TMT標(biāo)記后，聯(lián)合多維固相/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)，進(jìn)行搜庫和Mascot search engine(v.2.3.0)軟件分析，得到復(fù)發(fā)與正常復(fù)查隨訪間血清差異表達(dá)蛋白，并對(duì)質(zhì)譜結(jié)

4、果進(jìn)行質(zhì)控，同時(shí)對(duì)兩次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)性分析。對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.血清中共鑒定出635個(gè)蛋白，其中可定量蛋白為413個(gè)，設(shè)≥1.2倍，≤0.83倍為差異倍數(shù)。兩次實(shí)驗(yàn)中，在復(fù)發(fā)組均表現(xiàn)下調(diào)的為41個(gè)，均表現(xiàn)為上調(diào)的18個(gè)。并對(duì)2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)，用散點(diǎn)圖和皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson's Correlation Coefficient)進(jìn)行分析。結(jié)果表明2次實(shí)驗(yàn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上一致。同時(shí)

5、對(duì)酶解的肽段進(jìn)行質(zhì)控，肽段的質(zhì)量及其分布符合質(zhì)量要求。
　　2.對(duì)差異蛋白進(jìn)行基于GO的二級(jí)注釋分類
　　2.1上調(diào)蛋白主要參與單一結(jié)構(gòu)過程（26個(gè)蛋白），細(xì)胞生理過程（25個(gè)蛋白），應(yīng)激反應(yīng)（20個(gè)蛋白），生物調(diào)節(jié)（19個(gè)蛋白），定位作用（14個(gè)蛋白），代謝過程（13個(gè)），信號(hào)傳遞（12個(gè)），多細(xì)胞多組織的生物學(xué)過程（12個(gè)）等等。細(xì)胞構(gòu)成二級(jí)分類中，有23個(gè)分子位于胞內(nèi)區(qū)，21個(gè)位于細(xì)胞器內(nèi)，13個(gè)位于大分子化合物，11

6、個(gè)位細(xì)胞膜內(nèi)，10個(gè)分布在胞外區(qū)等。在分子功能分類中發(fā)揮與蛋白質(zhì)結(jié)合功能，參與分子有15個(gè)。催化活性的激活有11個(gè)分子參與，有6個(gè)分子參與了分子結(jié)構(gòu)激活，有3個(gè)參與了酶調(diào)節(jié)的激活，有1個(gè)參與電子活性的激活等。
　　2.2下調(diào)蛋白中，生物學(xué)過程分類顯示:主要參與單一結(jié)構(gòu)反應(yīng)過程（40個(gè)蛋白），生理調(diào)節(jié)過程（39個(gè)蛋白）細(xì)胞生理過程（27個(gè)蛋白），應(yīng)激反應(yīng)（35個(gè)蛋白），生物調(diào)節(jié)（19個(gè)蛋白），定位作用（13個(gè)蛋白），代謝過程（29個(gè)

7、），信號(hào)傳遞（12個(gè)），免疫反應(yīng)過程（17個(gè)），發(fā)育過程（12個(gè)），多細(xì)胞多組織的生物學(xué)過程（11個(gè)），多結(jié)構(gòu)反應(yīng)過程(8個(gè))等等。細(xì)胞構(gòu)成分類中，有23個(gè)蛋白位于胞內(nèi)區(qū)，20個(gè)位于細(xì)胞器內(nèi)，13個(gè)屬于大分子化合物構(gòu)成，20個(gè)位細(xì)胞膜內(nèi)，37個(gè)分布在胞外區(qū)，34在細(xì)胞內(nèi)等。分子功能分類中，上調(diào)蛋白主要發(fā)揮與蛋白質(zhì)結(jié)合功能，參與蛋白有36個(gè)。催化活性的激活有9個(gè)蛋白參與，有6個(gè)參與了酶調(diào)節(jié)的激活，有5個(gè)參與運(yùn)輸活性，有3個(gè)參與抗氧化作用，

8、有3個(gè)參與分子結(jié)構(gòu)活性作用等。
　　3.基于GO富集分析
　　3.1上調(diào)蛋白中，進(jìn)行生物學(xué)過程富集度分析表明，差異蛋白主要集中在負(fù)向調(diào)節(jié)運(yùn)輸活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，細(xì)胞支架的組成，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，負(fù)向調(diào)節(jié)分子功能，細(xì)胞吞噬作用。細(xì)胞構(gòu)成主要富集在內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)腔，基質(zhì)，粘著斑，細(xì)胞基質(zhì)粘連等。分子功能主要富集在與脂蛋白顆粒結(jié)合，低密度脂蛋白顆粒結(jié)合，未折疊蛋白的結(jié)合，膽固醇的結(jié)合功能等。
　　3.2下調(diào)蛋白中，富集度分析發(fā)現(xiàn)

9、，差異蛋白主要參與自我保護(hù)反應(yīng)，補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑，免疫球蛋白調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，淋巴調(diào)節(jié)免疫力，適應(yīng)性免疫反應(yīng)，對(duì)壓力的應(yīng)急反應(yīng)，激活免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程;而在細(xì)胞構(gòu)成的富集度分析中，差異蛋白主要為核小體，染色質(zhì)、運(yùn)輸質(zhì)子的ATP兩部分酶，運(yùn)輸質(zhì)子的ATP兩部分酶化合物等;在分子功能的富集度分析中，主要參與抗原結(jié)合，運(yùn)輸質(zhì)子的ATP合成酶，激活半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶抑制劑，MHC經(jīng)典途徑蛋白結(jié)合。
　　4.KEGG信號(hào)通路富集分析。兩次實(shí)驗(yàn)

10、中均出現(xiàn)hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human)，hsa04970 Salivary secretion-Homo sapiens(human)，hsa05144 Malaria-Homo sapiens(human)3條通路。在KEGG數(shù)據(jù)庫，hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human)豐度值最高、參與的基因數(shù)最多，最具有生物學(xué)意義。參與基因分別是CALM，H2B

11、，H3，H4，其中基因CALM在細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、腫瘤干細(xì)胞、DNA損傷、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、抗凋亡等作用相關(guān)。
　　5.結(jié)構(gòu)域的富集度分析。對(duì)差異蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行富集度分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要為鈣調(diào)蛋白同源結(jié)構(gòu)域、小能量結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域等。
　　6.聚類分析。對(duì)差異蛋白進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，在第1聚類中共有19個(gè)蛋白(A2M，ACTN4，ALB，ALDOA，APP，CFD，F(xiàn)13A1，F(xiàn)N1，HRG，KNG1，PF4，PLG，PPBP,

12、SERPINA1，SERPINE1，SERPING1，TIMP1，VWF)參與，其中，上調(diào)蛋白只有APP、SERPINE。下調(diào)蛋白包括A2M，ALB，F(xiàn)13A1，KNG1，SERPINA1，SERPING1。第二聚類中，包含APCS，APOA1，APOA4，CST3，F(xiàn)2，F(xiàn)GA，GSN，LTF，SERPINC1，TTR，其中，上調(diào)蛋白有APCS，F(xiàn)GA，SERPINC1。下調(diào)蛋白包括CST3，GSN。第三聚類中，包含APOA2，APO

13、B，APOC3，APOE，LCAT，LPL，其中上調(diào)蛋白包含APOA2，沒有下調(diào)蛋白。
　　7.蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析。篩選出的所有蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析，根據(jù)STRING網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)果分析，從差異蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖和網(wǎng)絡(luò)連接度看，網(wǎng)絡(luò)圖中連接程度較高的差異蛋白分別為ALB(degree=42)、APP(degree=34)、KNG1(degree=27)、F13A1(degree=25)、SERPING1(degree=25)、A2M

14、(degree=24)、SERPINA1(degree=22)。FGA(degree=19)、SERPINC1(degree=16)、APCS(degree=10)、GSN(degree=10)、APOA2(degree=9)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過TMT聯(lián)合質(zhì)譜分析并篩選出鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)表達(dá)蛋白，初步構(gòu)建了鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)差異蛋白表達(dá)譜;
　　2.基于質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析挖掘鼻咽癌復(fù)發(fā)的可能機(jī)制，其中，

15、我們認(rèn)為CALM、A2M、APP、ALB、F13A1、KNG1、SERPINA1、SERPINE1等是鼻咽癌復(fù)發(fā)潛在的相關(guān)標(biāo)志物，補(bǔ)體系統(tǒng)及CALM相關(guān)因素可能是鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的機(jī)制之一。
　　第二部分基于ELISA的血清差異蛋白表達(dá)驗(yàn)證
　　背景及目的：目前在蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)譜得出的結(jié)果往往需要進(jìn)行后期的驗(yàn)證進(jìn)一步證明質(zhì)譜結(jié)果的可靠性，重新收集血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA驗(yàn)證，同時(shí)探討該蛋白在鼻咽癌復(fù)發(fā)中的可能機(jī)制。

16、>　　方法：采集復(fù)發(fā)組50例和正常隨訪患者50例，進(jìn)行后期ELISA的血清差異蛋白驗(yàn)證。選擇CALM、A2M、APP三個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0和Prism5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P值＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.CALM蛋白結(jié)果:由于CALM濃度不符合正態(tài)分布，選取中位數(shù)及四分位法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行描述，復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組CALM濃度中位數(shù)分別為114.2ng/l和45.10ng/l;第

17、25％位數(shù)的濃度分別為56.08ng/l和23.08ng/l;第75％位數(shù)的濃度分別為240.lng/l和181.8ng/l;認(rèn)為兩組之間CALM表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)發(fā)組表達(dá)量高于正常復(fù)查隨訪組。ROC曲線下面積為0.6931，CALM最佳界值點(diǎn)為48.45ng/l，靈敏度為82.8％，特異度為55％。
　　2.APP蛋白結(jié)果:由于APP濃度不符合正態(tài)分布，選取中位數(shù)及四分位法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行描述，復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組APP濃

18、度中位數(shù)分別為20.08ng/ml和5.502ng/ml，第25％位數(shù)的濃度分別為4.561ng/ml和4.508ng/ml。第75％位數(shù)的濃度分別為28.90ng/ml和10.26ng/ml，認(rèn)為兩組之間APP表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，復(fù)發(fā)組表達(dá)量高于正常復(fù)查隨訪組。ROC曲線下面積為0.666，APP最佳界值點(diǎn)為16.95ng/ml，靈敏度為55.2％，特異度為90.9％。
　　3.A2M蛋白結(jié)果:由于A2M濃度不符合正態(tài)分布，選取中

19、位數(shù)及四分位法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行描述，復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組A2M濃度中位數(shù)分別為34.79ng/ml和75.67ng/ml，第25％位數(shù)的濃度分別為13.27ng/ml和40.03ng/ml;第75％的濃度分別為61.86ng/ml和151.92ng/ml，認(rèn)為兩組之間A2M表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不復(fù)發(fā)組表達(dá)量高于復(fù)發(fā)組。ROC曲線下面積為0.757，A2M最佳界值點(diǎn)為35.21ng/ml，靈敏度為56.5％，特異度為86.7％。