腺病毒載體介導(dǎo)的人Nanog基因修飾人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人Nanog基因重組腺病毒載體(Ad—Nanog),轉(zhuǎn)染人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs),檢測(cè)nanog基因在hucMSCs中的表達(dá),研究Nanog基因修飾對(duì)hucMSCs的生物學(xué)特性影響,希望能促進(jìn)hucMSCs維持自我更新能力及多向分化潛能,為基因修飾hucMSCs的后繼研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：設(shè)計(jì)含有KpnⅠ及Xho

2、Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增Nanog,將擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒上,經(jīng)雙酶切和基因測(cè)序鑒定,重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)PineⅠ線(xiàn)性化后,在含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重組,篩選獲得Ad-Nanog重組腺病毒質(zhì)粒,經(jīng)PacⅠ酶切線(xiàn)性化,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,包裝和擴(kuò)增病毒,并感染hucMSCs。通過(guò)免疫組織化學(xué),Western blot檢測(cè)Nanog在hucMSCs中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位；MTT

3、、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nanog修飾對(duì)hucMSCs增殖和克隆形成能力的作用；提取細(xì)胞的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)情況；裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Nanog修飾hucMSCs的生物安全性。
　　 結(jié)果：重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PCR和Xho1及Kpn1酶切鑒定正確,測(cè)序結(jié)果和設(shè)計(jì)片段的序列一致。熒光顯微鏡下觀(guān)察綠色熒光蛋白在感染的hucMSCs中高效表達(dá)。Nanog基因修飾促進(jìn)hucMSCs的增殖,克隆形成,成骨分化。