胱抑素C高表達對自發(fā)性高血壓大鼠左室重塑的影響.pdf

1、目的：半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白即胱抑素C(Cystatin C，Cys C)，其血清濃度測定是替代傳統(tǒng)的血尿素和肌酐(Cr)測定的首選腎功能評價指標。近年來，數(shù)據(jù)顯示CysC是心臟病終點事件（發(fā)病率、死亡率、心衰等）的早期危險標志物，與左室重塑及心功能障礙有高度相關(guān)性，尤其在老年人群及高血壓病人群?；邴}敏感大鼠的試驗結(jié)果顯示在心肌肥厚期CysC及Cats的mRNA及蛋白表達均升高。心衰期Cats表達繼續(xù)升高，而CysC的表達降低或相對降

2、低。以上數(shù)據(jù)顯示CysC不僅是慢性心衰的標志物，而且可能在高血壓病左室重塑中有重要作用。本實驗通過腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的CysC基因在SHR大鼠心肌中過表達，探索CysC與Cat K在SHR大鼠心肌的表達對左室重塑和心功能的影響。
　　 方法：
　　 l、實驗動物和設(shè)計
　　 選擇32周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)63只，隨機分為CysC腺病毒轉(zhuǎn)染高表達組、空載體對照組、空白對照組。同齡Wistar大鼠21只作陰性參照

3、。分批于腺病毒轉(zhuǎn)染前O天，注射后2天及4周處死大鼠。測量鼠尾動脈血壓，稱體重、左室質(zhì)量，計算左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI=左室重量/體重)。留取心尖（約1/2左心室）錫箔紙包裹后液氮冷凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆糜趒RT-PCR。余1/2左室組織經(jīng)4％中性多聚甲醛液固定48小時后石蠟包埋備用于免疫組織化學(xué)染色。
　　 2、病毒轉(zhuǎn)染
　　 大鼠麻醉后，剃除胸部毛發(fā)，PHILIPS公司IE33超聲儀，S12-5超聲探頭引導(dǎo)，取左室短軸

4、心底及心尖切面，應(yīng)用26G針頭分別于左室前壁及側(cè)壁共注射5.36×lOl0pfu/ml的Ad-CC或Ad-GFPIOOul，對照組注射等量PBS。
　　 3、超聲心動圖測量
　　 PHILIPS公司IE33心臟超聲儀，選S12-5超聲探頭，頻率5MHz，測量左室乳頭肌水平左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室短軸縮短分數(shù)(LVFS)及左室射血分數(shù)(LVEF)以評價心臟結(jié)構(gòu)及功能。
　　 4、實時定量多聚酶鏈反應(yīng)(qR

5、T-PCR)
　　 Trizol法提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄mRNA至cDNA，經(jīng)Primer5.0設(shè)計CysC特異引物，B-actin為內(nèi)參照，熒光定量PCR檢測CysC的mRNA相對表達。
　　 5、免疫組織化學(xué)染色
　　 取組織切片，進行CysC及CatK免疫組織化學(xué)染色，每只實驗動物選取5張切片，隨機分析3個視野，圖像采用IPP6.0軟件分析，取其平均累積光密度(IOD)，半定量分析蛋白表達。
　　

6、 6、Masson染色
　　 切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水，Masson復(fù)合染液及亮綠染液染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡觀察，并采集圖像。IPP6.0軟件分析，選取3個無血管視野測定膠原纖維在每個視野中所占比率，最后取均數(shù)代表總膠原容積評分(CVF)=膠原面積/總面積。
　　 7、統(tǒng)計學(xué)處理各項觀察指標以均數(shù)±標準差(X±S)表示，單因素方差分析。利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，P

7、示有差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、實驗過程中3只SHR大鼠死亡，高表達組2只，空載體組1只，最終60只完成實驗。其中高表達組19只，空載體組20只，對照組21只。
　　 2、與對照組比較，CysC在高表達組轉(zhuǎn)染后2天表達最高(P

8、W組降低(P<0.05)。
　　 3、CysC高表達組大鼠LVMI、LVEDD及LVFS較對照組有差異(P<0.05)。CVF也增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=O.076)。空載體組較對照組無差別。與W組比較，SHR各組大鼠LVMI、LVEDD及LVFS均有明顯差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、超聲引導(dǎo)心肌局部注射成功實現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的CysC心肌局部高表達，減少實驗大鼠的死亡率。2、慢性心衰期SHR大鼠心