Bhas42細胞轉化試驗方法學及其應用研究.pdf

1、現(xiàn)有的致癌性短期預測遺傳毒性試驗,大多只限于檢測遺傳毒性致癌物(genotoxiccarcinogen),而不能檢測非遺傳毒性致癌物(non-genotoxiccarcinogen)。建立快速、簡便、可靠的體外方法檢測非遺傳毒性致癌物在藥物早期研發(fā)階段具有重要意義,是當前安全性評價毒理學研究中亟需解決的問題。
　　細胞轉化試驗通常采用細胞灶法判定結果,但該方法費時且主觀性較強。本研究在細胞灶法的基礎上,建立以H2O2法判定結果的B

2、has42細胞轉化試驗方法,并應用于藥物安全性評價中。Bhas42細胞是將v-Ha-ras基因導入Balb/c3T3細胞中而建成的細胞系,已處于啟動狀態(tài),非遺傳毒性致癌物暴露下不經(jīng)過啟動劑的預處理便可引起細胞惡性轉化。H2O2可以殺死未發(fā)生轉化的正常細胞,而對轉化細胞不產(chǎn)生影響。化學物處理的細胞經(jīng)CCK-8染色后,根據(jù)其存活率確定細胞轉化程度,從而判定化學物的非遺傳毒性。
　　1、研究方法。
　　本研究包括Bhas42細胞轉

3、化試驗方法的建立和應用二部分。研究內(nèi)容如下:
　　第一部分:實驗方法的建立及驗證。1)選用3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene,3-MCA)和佛波醇12-十四酸13-乙酸酯(Phorbol12-myristate13-acetate,TPA)作為陽性劑,在血清批號等培養(yǎng)條件穩(wěn)定后確定細胞接種濃度、陽性劑濃度,建立以細胞灶法判定結果的Bhas42細胞轉化試驗方法。2)通過Balb/c3T3和Bhas42細胞轉化試驗

4、確定CCK-8染色時間和H2O2濃度與作用時間點,并驗證所選條件是否合適。3)選用已知的遺傳毒性致癌物乙基亞硝基脲(N-Nitroso-N-Ethylurea,ENU)和非遺傳毒性致癌物12,13-二癸酸佛波醇(Phorbol12,13-didecanoate,PDD)及石膽酸(Lithochoticacid,LCA)驗證以H2O2法判定結果的Bhas42細胞轉化試驗方法。
　　第二部分:實驗方法的應用。1)選用兩種植物雌激素染料

5、木黃酮(Genistein,GEN)和葛根素進行檢測。2)選用兩種食品添加劑沒食子酸乙酯和甜蜜素進行檢測。
　　2、研究結果
　　1)批號為737443的胎牛血清培養(yǎng)Bhas42細胞時,每孔產(chǎn)生的集落數(shù)最多。細胞生長試驗中確定啟動試驗細胞接種濃度為200cells·well-1、3-MCA濃度為1μg·ml-1時相對生長率接近50％。促癌試驗細胞接種濃度為400cells·well-1、TPA濃度為50ng·ml-1時相對生

6、長率接近100%。按以上條件進行以細胞灶法判定結果的細胞轉化試驗,3-MCA和TPA組轉化灶個數(shù)通過卡方檢驗(p<0.01)均相對于對照組有顯著性差異。2)通過Balb/c3T3細胞轉化試驗,CCK-8染色4h后OD值基本達到平穩(wěn),各濃度組之間差距也較明顯。第5組細胞中0.0012%和0.0020%的H2O2處理的陽性組的OD值均高于陰性組。通過Bhas42細胞轉化試驗對H2O2濃度進一步優(yōu)化,當H2O2濃度為0.0016%時,陽性組與

7、陰性組之間的差異最大,且陽性組存活率較高。3)ENU在啟動試驗中有10、100、150μg·ml-1三個濃度組相對于對照組有顯著差異,且有兩個為連續(xù)濃度。PDD在促癌試驗中0.05、0.1、0.2、0.3、0.4μg·ml-1五個濃度組相對于對照組均有顯著差異。LCA在促癌試驗中有5、8、12μg·ml-1三個連續(xù)濃度組相對于對照組有顯著差異(Dunnett-ttest,p<0.01)。4)在啟動試驗中,GEN和葛根素的各個濃度組相對于

8、對照組均無顯著性差異。在促癌試驗中,GEN有0.03、1、3μg·ml-1三個濃度組相對于對照組有顯著性差異,且有兩個為連續(xù)濃度。葛根素只有3μg·ml-1一個濃度組相對對照組有顯著性差異。5)在啟動試驗中,沒食子酸乙酯僅1μg·ml-1一個濃度組相對于對照組有顯著性差異。而在促癌試驗中,沒食子酸乙酯濃度為0.1μg·ml-1時相對于對照組有差異,1、3μg·ml-1時相對于對照組有顯著性差異。在啟動試驗中,甜蜜素濃度為30μg·ml-

9、1時相對于對照組有差異。在促癌試驗中,甜蜜素濃度為10μg·ml-1時相對于對照組有差異,濃度為30、300、1000μg·ml-1時相對于對照組有顯著性差異。
　　3、結論
　　1)試驗選用批號為737443的胎牛血清。啟動試驗細胞接種濃度為200cells·well-1、3-MCA濃度為1μg·ml-1,促癌試驗細胞接種濃度為400cells·well-1、TPA濃度為50ng·ml-1進行的以細胞灶法判定結果的細胞轉化

10、試驗,3-MCA和TPA組均表現(xiàn)為陽性,證明該方法在本實驗室建立成功。以H2O2法判定結果的Bhas42細胞轉化試驗采用濃度為0.0016%的H2O2,在第19天處理細胞24h,CCK-8染色4h后在450nm下測定OD值。三種已知致癌物進行驗證,均得到陽性結果,驗證了該方法的可靠性和準確性。
　　4)根據(jù)GEN和葛根素的細胞轉化試驗,GEN在啟動試驗中表現(xiàn)為陰性,而在促癌試驗中表現(xiàn)為陽性,表明GEN可能為非遺傳毒性致癌物。葛根素