免疫藥實(shí)驗(yàn)方法-藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)-研究生

1、1,影響免疫功能藥物藥理研究方法中藥藥理教研室 洪敏唐仲英科技樓406 Tel：15805191595Email:hongmin72@126.com,2,第一節(jié) 概述一、免疫學(xué)研究概況 免疫學(xué)的3個(gè)時(shí)期： 經(jīng)驗(yàn)免疫期 科學(xué)免疫期 現(xiàn)代免疫期,3,●經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)時(shí)期 中國(guó)明代，正式記載接種“人痘”

2、，預(yù)防天花 18世紀(jì)中葉，英國(guó)醫(yī)生Edward Jenner 種牛痘預(yù)防天花 目前，通過(guò)全球性大面積疫苗接種我們已經(jīng)消滅了天花病毒,4,5,● 科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期,病原菌的發(fā)現(xiàn)與疫苗使用的推廣 19世紀(jì)中葉，顯微鏡的改進(jìn)使人們可在鏡下直接觀察到細(xì)菌，導(dǎo)致病原菌的發(fā)現(xiàn)。 1850年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽桿菌。 Pasteur證明實(shí)驗(yàn)室培

3、養(yǎng)的炭疽桿菌能使動(dòng)物感染致病，并且發(fā)明了液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)細(xì)菌。 Koch發(fā)明固體培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)結(jié)核桿菌成功，提出病原菌致病的概念。,Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel Prize in 1901 for demonstrating that circulating antitoxins against diphtheria（白喉）and tetanus（破傷風(fēng)）toxins

4、 conferred immunity.,Louis Pasteur 1822-1895, Father of immunology, attenuated bacteria and viruses as vaccine against anthrax（炭疽）…..,Edward Jenner 1749-1822Successful vaccination against smallpox（天花）,Robert Koch 1843-1

5、910, Nobel Prize in 1905 for his work on tuberculosis（肺結(jié)核）, Anthrax（炭疽）, Cholera（霍亂）, Tubercule bacillus（結(jié)核桿菌）,8,科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期的重要成就,減毒疫苗的發(fā)明 抗毒素的發(fā)現(xiàn) 補(bǔ)體的發(fā)現(xiàn) 血清學(xué)方法的建立 免疫化學(xué)的研究,●現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期,免疫應(yīng)答細(xì)胞和T細(xì)胞亞類的發(fā)現(xiàn) 免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)的提出 抗體生成克隆選擇學(xué)說(shuō)

6、的提出 細(xì)胞因子研究進(jìn)展 免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展（免疫標(biāo)記技術(shù)） 免疫耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),,Clonal Selection Theory（ Burnet學(xué)說(shuō), 1960年諾貝爾獎(jiǎng)）體內(nèi)存有能識(shí)別各種抗原的細(xì)胞克隆(clone)，每一細(xì)胞表面均有對(duì)特定抗原的受體，能與相應(yīng)抗原結(jié)合而識(shí)別它們?？乖淖饔迷谟谶x擇與其相應(yīng)的細(xì)胞克隆與其受體結(jié)合后，引起細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 胎生期免疫細(xì)胞與自己抗原相接觸形成天然自身耐受狀態(tài)（禁忌

7、細(xì)胞系） 免疫細(xì)胞系可突變產(chǎn)生與自己抗原發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞系可形成自身免疫反應(yīng) 此學(xué)說(shuō)對(duì)免疫學(xué)中的根本問(wèn)題——自我識(shí)別有了比較滿意的解釋，對(duì)免疫學(xué)中的其他重要問(wèn)題，諸如免疫記憶、免疫耐受性、自身免疫性等現(xiàn)象也能作出恰當(dāng)?shù)恼f(shuō)明，因此被人們廣為接受，成為現(xiàn)代免疫學(xué)的理論基礎(chǔ)。,11,,12,● 研究進(jìn)展,1.抗原識(shí)別受體多樣性的產(chǎn)生2.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的發(fā)現(xiàn)3.細(xì)胞程序性死亡途徑的發(fā)現(xiàn)4.造血與免疫細(xì)胞的發(fā)育5.應(yīng)用免疫學(xué)的發(fā)展

8、 (1)DNA疫苗 (2)基因工程制備重組細(xì)胞因子 (3)免疫細(xì)胞治療 (4)完全人源抗體 (5)口服自身抗原,預(yù)防自身免疫病,13,二、免疫功能的病理生理及免疫功能的調(diào)節(jié) ● 免疫應(yīng)答：是機(jī)體借助理化屏障及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)控制，通過(guò)免疫細(xì)胞及有關(guān)的體液因子（抗體or淋巴因子等）發(fā)揮識(shí)別自己、排除異己，以維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境統(tǒng)一的一種功能。 ● 非特異性免疫應(yīng)答：是機(jī)體防御異物進(jìn)入機(jī)體以及對(duì)進(jìn)入體內(nèi)

9、異物的清除作用，是機(jī)體與生俱來(lái)的免疫功能。 ● 特異性免疫應(yīng)答：是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中接觸抗原后發(fā)展而成的免疫力，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。,14,免疫應(yīng)答的3個(gè)階段： （1）感應(yīng)期 抗原進(jìn)入機(jī)體后，多數(shù)由單核－巨噬細(xì)胞攝取與加工，再將抗原信息傳遞給T、B淋巴細(xì)胞，使之能特異性地識(shí)別抗原。 （2）增殖分化期 抗原激活――淋巴細(xì)胞――T、B淋巴細(xì)胞――致敏淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞。 （3）效應(yīng)期 再次遇到抗原

10、――致敏淋巴細(xì)胞、抗體――細(xì)胞免疫、體液免疫。,15,16,18,19,免疫病理與免疫性疾病,按發(fā)病機(jī)制不同,免疫性疾病分為： 超敏反應(yīng)性疾病 免疫缺陷病：先天性及繼發(fā)型免疫缺陷病 自身免疫?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡,干燥 綜合征,多發(fā)性硬化 移植排斥和移植物抗宿主反應(yīng),,,速發(fā)型：由抗體

11、介導(dǎo)， 發(fā)作快 如：哮喘、蕁麻疹等 遲發(fā)型：由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，發(fā)作慢 見于結(jié)核病、接觸性皮炎,,20,目前臨床所用的影響免疫功能的藥物有： ● 免疫增強(qiáng)藥：胸腺素、卡介苗、干擾素（免疫調(diào)節(jié)）、左旋咪唑等。 ● 免疫抑制藥：環(huán)孢素A、他克莫司、糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、抗淋巴細(xì)胞球蛋白。 ● 中藥類： 雙向免疫調(diào)節(jié)，如：人參、黃

12、芪、靈芝、豬苓、枸杞、銀耳、鹿茸、云芝等植物多糖。 免疫抑制，如：川烏總堿、氧化苦參堿、雷公藤多苷、生物堿等。,21,中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析,2009;9(10):726-729,22,三、研究的基本要求（一）動(dòng)物的選擇 由于免疫反應(yīng)和基因類型有關(guān)，盡可能用純系動(dòng)物。如純系小鼠和大鼠，并控制鼠齡、性別和體重，以減少個(gè)體差異。若用雜種動(dòng)物，最好用同窩動(dòng)物。,23,（二） 動(dòng)物模型 1、模型特點(diǎn)和要求

13、 （1）正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 （2）免疫功能低下的動(dòng)物模型（腫瘤、衰老、慢性病均可造成免疫功能低下） ① 免疫抑制劑造模（如環(huán)磷酰胺、氫化可的松、環(huán)孢霉素A） ② 輻射引起免疫功能低下動(dòng)物模型,24,常用的免疫抑制劑 1. 環(huán)磷酰胺：80～100mg/kg，Sc，5天后免疫功能顯著降低。 2. 氫化可的松：50～100mg/kg，Sc，6～8天后免疫功能顯著降低。

14、 3. 抗淋巴細(xì)胞血清（ALS）:ip 0.2ml，5～6天后免疫功能顯著降低。 4. 60Co或X射線600～800拉德照射1次，4日后免疫功能顯著降低，動(dòng)物存活時(shí)間顯著縮短。,25,（3）免疫缺陷動(dòng)物 Nude小鼠：該小鼠先天性無(wú)胸腺，細(xì)胞免疫力低下，失去正常T細(xì)胞功能。但其B淋巴細(xì)胞功能基本正常。BALB/c–nu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu  

15、 Scid小鼠：即重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠。Scid 小鼠外觀與普通小鼠差別不大，有毛，被毛白色，體重發(fā)育正常。但胸腺、脾、淋巴結(jié)的重量不及正常的30%，組織學(xué)上表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞顯著缺陷。 BALB/c-Scid,26,（4）自身免疫性疾病模型： 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥 （5）過(guò)敏性疾病模型： 哮喘，過(guò)敏性鼻炎，接觸性皮炎等,,27,佐劑性關(guān)節(jié)炎模型是免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型

16、的基本方法。造模多采用大鼠, 足跖部皮下注射法, 原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應(yīng), 續(xù)發(fā)病變一般于致炎后10-20天左右出現(xiàn), 20天左右達(dá)到高峰, 病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥, 滑膜增生, 血管翳形成, 軟骨破壞, 4周后, 關(guān)節(jié)紅腫減退, 骨質(zhì)減少, 新骨形成, 關(guān)節(jié)間隙變窄, 形成不可逆的關(guān)節(jié)改變。AA大鼠的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)及血中變化與人相似, 同時(shí), 對(duì)其免疫學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn), 此模型存在明顯的細(xì)胞免疫異常。,28,II 型

17、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型II 型膠原+完全弗氏佐劑, 乳化制成乳劑, 將該乳劑于小鼠的尾根部皮內(nèi)注射致炎, 腹腔注射乳劑作為激發(fā)注射。表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎, 關(guān)節(jié)局部紅腫, 嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形, 病理變化為增生性滑膜炎, 關(guān)節(jié)軟骨破壞, 骨侵蝕, 關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 體內(nèi)可檢出針對(duì)自身型膠原的高滴度的IgG抗體, 這些臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與人密切相關(guān)。不出現(xiàn)病情的波動(dòng)和復(fù)發(fā)情況, 也沒(méi)有的皮下結(jié)節(jié), 漿膜炎, 血管炎等表現(xiàn),不出現(xiàn)

18、類風(fēng)濕因子及抗核抗體,29,卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型卵蛋白+福氏佐劑混勻, 注入動(dòng)物背部皮下, 致敏, 末次注射后一周于關(guān)節(jié)內(nèi)注入溶解的卵蛋白, 24小時(shí)內(nèi)此關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛等急性炎癥的表現(xiàn), 發(fā)病率達(dá)100%。卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的病理改變有滑膜增生、血管翳形成和軟骨及骨破壞。第一階段為關(guān)節(jié)內(nèi)注入抗原后, 24小時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹, 關(guān)節(jié)直徑增加, 病理表現(xiàn)為急性滑膜炎。第二階段為1-4周, 關(guān)節(jié)滑膜明顯增生, 血管翳形成。滑膜細(xì)

19、胞以單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主,其次為淋巴細(xì)胞, 以CD4+淋巴細(xì)胞多見, 這一階段部分動(dòng)物可出現(xiàn)早期軟骨破壞。第三階段在4周后, 不可逆的關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞出現(xiàn),最后可出現(xiàn)骨變形。最長(zhǎng)的觀察到6個(gè)月, 慢性炎癥仍存在, 證明卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型與在發(fā)病機(jī)理上的某些類似。,,30,2、觀察指標(biāo) （1）非特異性免疫功能的測(cè)定指標(biāo) （2）體液免疫功能的測(cè)定指標(biāo) （3）細(xì)胞免疫功能的測(cè)定指標(biāo)3、給藥途徑和劑量4、對(duì)照實(shí)驗(yàn),31,,（1

20、）組間對(duì)照,標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組弱陽(yáng)性對(duì)照組,（2）自身對(duì)照（3）配對(duì)對(duì)照,對(duì)照組,陰性對(duì)照組,空白對(duì)照組,假處理對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組,,,,,32,第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法一、影響非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)（一）碳粒廓清法【基本原理】 網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）是機(jī)體最主要的防御系統(tǒng)，具有強(qiáng)大而迅速的吞噬廓清異體顆粒或某些可溶性異物的能力，并能迅速清除體內(nèi)自身產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)。 當(dāng)靜脈注入特定大小的惰性顆粒后，它即可被RES細(xì)胞

21、迅速吞噬而從血流中廓清，因此，可借助測(cè)定血流中炭粒的消失速度來(lái)反映RES吞噬異物的能力。,33,【實(shí)驗(yàn)步驟】（1）取小鼠，隨機(jī)分組，給藥。（2）末次給藥后30min，每鼠iv印度墨汁0.05～0.1ml/10g體重。（3）于1min（t1）和5min（t5）后，每鼠眼眶靜脈取血20ml，加到2ml 0.1%NaCO3溶液中搖勻。（4）測(cè)OD680nm，計(jì)算廓清指數(shù)（K）、吞噬指數(shù)。,34,廓清指數(shù)K＝

22、 ＝ 吞噬指數(shù)α＝ × 即校正廓清指數(shù),,,,,35,【注意事項(xiàng)】 （1）印度墨汁應(yīng)用NS稀釋1～5倍左右，最好經(jīng)超聲處理后離心，棄去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛細(xì)血管，引起動(dòng)物猝死。 印度墨汁的質(zhì)量可影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，墨汁顆粒大小有嚴(yán)格要求，過(guò)大則不被吞噬，

23、過(guò)小則被其他吞噬細(xì)胞吞噬，如小吞噬細(xì)胞。印度墨汁因顆粒大小均勻，能特異性地被單核巨噬細(xì)胞所吞噬，因而適用于本實(shí)驗(yàn)。 （2）iv要熟練，印度墨汁的劑量、取血時(shí)間必須準(zhǔn)確無(wú)誤。另外，取血的時(shí)間間隔也可延長(zhǎng)至10分鐘。,36,【評(píng)價(jià)】 印度墨汁法測(cè)定RES吞噬活性是最經(jīng)典的一種免疫學(xué)研究方法，實(shí)驗(yàn)條件要求不高，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好。 若再配合小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬消化雞紅血球?qū)嶒?yàn)及白細(xì)胞游走實(shí)驗(yàn)，則可較全面地反

24、映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除異物功能狀態(tài)。,37,（二）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞法【基本原理】 Mφ具有強(qiáng)大的吞噬能力，雞紅細(xì)胞對(duì)鼠類是一種較強(qiáng)的抗原性異物，當(dāng)其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔Mφ聚集并吞噬，注入定量雞紅細(xì)胞（CRBC），隔一定時(shí)間后，吸取腹腔Mφ，鏡檢其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指數(shù)的高低表示Mφ吞噬能力的大小。,38,【實(shí)驗(yàn)步驟】 （1）取18～22g小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組。 （2）若篩選免疫抑

25、制藥，預(yù)先用Mφ誘導(dǎo)劑，可在實(shí)驗(yàn)前3～4天，ip0.5％淀粉生理鹽水溶液，每鼠0.5ml。 （3）4天后，ip，5％ CRBC 0.5ml。8～12h后脫頸椎處死小鼠，ip2ml NS，輕揉腹部1min，然后吸出洗液1ml，分滴于兩片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。 （4）用NS漂洗，除去未粘片的細(xì)胞。晾干，1∶1丙酮－甲醇溶液固定5min。4％（V/V）Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，用

26、流水沖洗、晾干，鏡檢。,39,【結(jié)果判定】 油鏡下計(jì)每片200個(gè)Mφ，計(jì)算吞噬百分率、吞噬指數(shù)。吞噬百分率＝ ×100％ 吞噬指數(shù)＝ ÷2,,40,CRBC被消化的程度，通常分4級(jí)： Ⅰ級(jí)：未消化。CRBC完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核呈淺紫紅色。 Ⅱ級(jí)

27、：輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍(lán)色。 Ⅲ級(jí)：重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。 Ⅳ級(jí)：完全消化。Mφ內(nèi)僅見形態(tài)類似CRBC大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。,41,【注意事項(xiàng)】 （1）實(shí)驗(yàn)各步驟均需保持無(wú)菌操作。Mφ誘導(dǎo)劑僅用于免疫抑制藥研究。 （2）若滴片染色過(guò)深，可用1%HCl脫色，過(guò)淺則可復(fù)染。 （3）每鼠兩片的計(jì)數(shù)應(yīng)基本一致，若差距過(guò)大，應(yīng)予淘汰。腹腔吸出的液體若有血性滲出時(shí)，則不宜使用。,42

28、,（4）掌握好實(shí)驗(yàn)時(shí)間，時(shí)間太短，吞噬雞紅細(xì)胞較少，過(guò)長(zhǎng)則雞紅細(xì)胞已被消化。 （5）避免腹腔注射受試藥物，以免干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！驹u(píng)價(jià)】 本法簡(jiǎn)便，但操作慢而欠精確，可配合其他方法進(jìn)行綜合分析。,43,（三）巨噬細(xì)胞吞噬作用的化學(xué)發(fā)光測(cè)定法【基本原理】 化學(xué)反應(yīng)中電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，在其回到基態(tài)過(guò)程中，以光的形式釋放能量or將能量轉(zhuǎn)移到另一分子而發(fā)射光子，利用發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)射光的強(qiáng)度or速度，即可計(jì)算發(fā)光物質(zhì)or

29、發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗原or抗體的含量。測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度的方法，即光子計(jì)數(shù)法，可用液體閃爍儀進(jìn)行測(cè)定。,44,Mφ吞噬顆粒or受其他生物與化學(xué)因子刺激后，細(xì)胞代謝猛增，其特征是耗氧量增加，產(chǎn)生大量自由基（氧負(fù)離子、過(guò)氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧），同時(shí)，往往伴有化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，但十分微弱，難以檢測(cè)。若在體系中加入魯米諾等發(fā)光增強(qiáng)劑，就能增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，因?yàn)檠趸瘎┘ぐl(fā)魯米諾，可發(fā)出425nm的光，易被檢測(cè)到。,45,【操作步驟】 （1）用HBSS將Mφ

30、調(diào)整至2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。 （2）取細(xì)胞懸液1ml，置聚乙烯小管中，加入10-4M魯米諾200ml，將小管放入液閃測(cè)量瓶中，測(cè)定發(fā)光6秒鐘，作為本底。 （3）加入調(diào)理的酵母多糖200ml，搖勻，即刻測(cè)發(fā)光6秒鐘，以后每隔3～5min測(cè)一次發(fā)光，直至加酵母多糖1h。 （4）以發(fā)光強(qiáng)度（cpm）為縱坐標(biāo)，加酵母多糖后的時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制Mφ吞噬發(fā)光的動(dòng)力曲線。比較各組的峰高、峰時(shí)（峰高的時(shí)間）、發(fā)光積分值及早期

31、曲線斜率的變化。,46,【注意事項(xiàng)】 （1）注意無(wú)菌操作。所用試管、滴管、緩沖液等均需高壓滅菌，應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)操作，避免污染。 （2）用臺(tái)盼藍(lán)染色，Mφ活力應(yīng)在90％以上。 （3）所用藥物應(yīng)能完全溶解，懸浮的微粒將會(huì)影響Mφ的反應(yīng)性。 （4）小試管與測(cè)量瓶先置暗室24h，整個(gè)操作系統(tǒng)均在暗室進(jìn)行。,47,【方法評(píng)價(jià)】 （1）本法也可檢測(cè)Mφ氧代謝功能與血清調(diào)理作用，故作為檢測(cè)吞噬功能的指標(biāo)的專一性不夠。 （2）因液

32、閃儀無(wú)溫控裝置，不能使反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到37℃，只能通過(guò)恒定的室溫（25±1℃）與水浴37℃進(jìn)行間接控制。,48,（四）溶菌酶測(cè)定法【基本原理】 溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機(jī)體的淚液、痰、鼻涕、WBC、血清等。測(cè)定它在體液or分泌物中的含量及其變動(dòng)情況，可作為側(cè)面了解機(jī)體防御功能的一個(gè)指標(biāo)。 體液和分泌物中的溶菌酶活性，可通過(guò)檢查其對(duì)指定敏感菌株的裂解作用來(lái)進(jìn)行測(cè)定。,49,2種測(cè)定法：（1）光學(xué)測(cè)定法

33、：將檢品與菌液混合，用分光光度計(jì)觀察指定時(shí)間內(nèi)透光度改變的百分?jǐn)?shù)。（2）平板打孔測(cè)定法：在混有菌液的瓊脂凝膠上打孔，檢品放在孔內(nèi)，一定時(shí)間后測(cè)定溶菌環(huán)直徑。,50,二、影響特異性體液免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）血清溶血素測(cè)定法【基本原理】 經(jīng)SRBC免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），并釋放至外周血。這種抗體在試管內(nèi)與SRBC溫育，在補(bǔ)體（正常血清中的一組酶蛋白，具有溶解和殺傷細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬等作用）參與下可產(chǎn)生

34、溶血反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定血紅蛋白的釋放量多少來(lái)間接測(cè)出血清中溶血素的含量。 血紅蛋白與都氏試劑反應(yīng)形成氰化血紅蛋白后比色測(cè)定。,51,【操作步驟】 （1）免疫：小鼠，ip 20％SRBC 0.2ml/天，第4天取血、分離血清，將血清稀釋后供測(cè)定（一般500倍以上）。 （2）溶血反應(yīng)：在試管內(nèi)依次加入血清1ml、5％SRBC 0.5ml、10％補(bǔ)體1ml，置37℃水浴30min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，1500rpm離心5min

35、，取上清1ml，加都氏液3ml，搖勻放置10min，測(cè)OD540nm。,52,（3）SRBC半數(shù)溶血值：取5％SRBC 0.25ml加都氏液4ml，測(cè)OD540nm。 （4）計(jì)算：樣品管半數(shù)溶血值HC50： 每只鼠的血清 HC50＝ ×稀釋倍數(shù),,53,【

36、評(píng)價(jià)】 （1）簡(jiǎn)單易行，快速，重復(fù)性好。測(cè)定HC50較準(zhǔn)確，客觀，可克服溶血空斑法用肉眼計(jì)數(shù)的錯(cuò)誤。 （2）本實(shí)驗(yàn)用615純種小鼠測(cè)出的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。,54,（二）抗體形成細(xì)胞測(cè)定法（PFC）1 溶血空斑試驗(yàn)（haemolytic plaque assay，HPA）【基本原理】 PFC是一種體外檢測(cè)單個(gè)抗體形成細(xì)胞（漿細(xì)胞）的方法。將SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞、SRBC、補(bǔ)體混合于瓊脂內(nèi)，抗體形成細(xì)胞分泌的抗

37、體在補(bǔ)體的參與下，使其周圍的SRBC的溶解形成肉眼可見的溶血空斑，這種溶血空斑大體上可以反映抗體形成細(xì)胞數(shù)。 方法：瓊脂固相法（平皿法）：常用。 液相單層細(xì)胞法（玻片法）：很少使用。,56,直接溶血空斑試驗(yàn):測(cè)定產(chǎn)生 IgM 型抗體的細(xì)胞。因?yàn)榛罨a(bǔ)體的能力強(qiáng)，只加細(xì)胞和補(bǔ)體即可出現(xiàn)空斑，故稱直接溶血空斑測(cè)定。間接溶血空斑試驗(yàn): 產(chǎn)生其他類型抗體的（如 IgG 或 IgA 等）細(xì)胞檢測(cè)，需要加靶細(xì)

38、胞和抗各類 Ig 的抗血清,再加補(bǔ)體才能出現(xiàn)可見的空斑，故稱間接溶血空斑測(cè)定。,57,【操作步驟】（1）瓊脂固相法――直接法 1）免疫動(dòng)物：選用純系小鼠，隨機(jī)分組，每鼠腹腔注射5％的SRBC 0.2ml致敏。 2）制備補(bǔ)體，同前。 3）制備底層瓊脂：稱取1.4g瓊脂糖加入100mlGey’s液中，煮沸，溶化后分裝若干只預(yù)溫的試管，每管5ml，置45℃恒溫水浴保溫。然后傾入水平放置的平皿（直徑9cm）中，凝固后打

39、開平皿蓋，將平皿反扣放入37℃溫箱1h，備用。,58,4）制備脾細(xì)胞懸液：免疫后第4天，用冷Gey’s制備107/ml脾細(xì)胞懸液，置4℃冰箱備用。5）上層瓊脂的制備：稱取0.7瓊脂糖加入100mlGey’s液中煮沸，溶化后分裝若干只預(yù)溫的試管，每管1.5ml，置45℃恒溫水浴保溫。逐個(gè)取出，依次加入SRBC懸液（2×109/ml）0.1ml、107/ml脾細(xì)胞懸液0.1ml，充分混勻，立即傾入上述制備好的底層瓊脂平皿中，均勻

40、鋪平，凝固后靜止10min。,59,6）將平皿置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，每皿中加入1∶10稀釋的豚鼠血清1.0ml，均勻覆蓋于表面，繼續(xù)溫育40～50min，取出后置室溫1h，4℃冰箱過(guò)夜，次日傾去補(bǔ)體，or加入0.25%的戊二醛（NS配置），使細(xì)胞固定后計(jì)數(shù)空斑。,60,7）空斑計(jì)數(shù)與評(píng)定：用放大鏡or雙目解剖鏡可見每個(gè)空斑由抗體分泌細(xì)胞及其周圍的透明區(qū)域組成。計(jì)數(shù)每個(gè)平皿（106個(gè)細(xì)胞）的空斑數(shù)。（2）瓊脂固相法――間接

41、法：在上述5）中再加入適當(dāng)濃度的抗-Ig血清0.1ml，其他步驟相同。,61,【注意事項(xiàng)】（1）SRBC既是免疫細(xì)胞，又是靶細(xì)胞和指示細(xì)胞，故SRBC要新鮮，洗滌不得超過(guò)3次，每次離心5min。用Alsever’s液保存的SRBC可使用2周。 （2）為了消除非特異性溶血，豚鼠血清在使用前必須經(jīng)SRBC吸收，補(bǔ)體的濃度以1∶10稀釋為宜。,62,（3）制備脾細(xì)胞懸液：若將取出的脾立即放入0℃冰浴，可明顯降低空斑計(jì)數(shù)；在20℃以下操作，

42、不超過(guò)15min，對(duì)空斑計(jì)數(shù)并無(wú)影響。 （4）測(cè)定抗血清的顯斑常數(shù)（KD）和抑斑常數(shù)（KI），作為空斑計(jì)數(shù)的校正。,63,（5）傾注底層瓊脂糖時(shí)，一定要將平皿放置水平位置，以便使底層瓊脂糖水平光滑。傾上層瓊脂糖時(shí)，各種細(xì)胞成分要充分混勻。不能劇烈震蕩，以免出現(xiàn)氣泡。水浴溫度應(yīng)控制在47～49℃之間，溫度過(guò)高使細(xì)胞變性；過(guò)低使瓊脂糖凝固，影響細(xì)胞分散。,64,2 分光光度法【基本原理】 又稱SRBC的定量溶血測(cè)定法，基本原理

43、同溶血空斑法。但本法可定量測(cè)定抗體形成細(xì)胞所分泌的抗體，較溶血空斑法精確。同時(shí)操作比較簡(jiǎn)便。,65,【操作步驟】 （1）免疫動(dòng)物：同前。 （2）制備脾細(xì)胞懸液：基本同前，制成5×106/ml脾細(xì)胞懸液，或按15mg脾重/ml制成脾細(xì)胞懸液。 （3）溶血反應(yīng)：取試管若干只，每管依次加入脾細(xì)胞懸液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混勻，另設(shè)不加補(bǔ)體的空白組。置37℃水浴中溫育1h，離心3000rpm，5m

44、in。 （4）測(cè)OD值：取上清測(cè)OD413nm。,66,【注意事項(xiàng)】 （1）若使用雜種鼠時(shí)，宜將每?jī)芍恍∈蟮钠⒒旌弦褐苽淦⒓?xì)胞懸液，可減少實(shí)驗(yàn)誤差。 （2）反應(yīng)系統(tǒng)中其他條件不變時(shí)，SRBC濃度可根據(jù)受試藥的免疫增強(qiáng)or抑制作用作適當(dāng)調(diào)整。,67,三、影響特異性細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（3H-TdR摻入法）【基本原理】 淋巴細(xì)胞在有絲分裂原的刺激下，轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞，并分化增殖，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸

45、合成增加，并釋放多種淋巴因子。如在培養(yǎng)液中加入3H-TdR，使其摻入到新合成的DNA中，可以定量細(xì)胞內(nèi)的DNA合成強(qiáng)度。,68,有絲分裂原： PHA（植物血凝素） ――刺激T細(xì)胞 Con-A（刀豆球蛋白） ――刺激T細(xì)胞 LPS（脂多糖） ――刺激B細(xì)胞,69,【操作步驟】 （1）純系小鼠，2～3月齡，雌雄均可。處死小鼠，在無(wú)菌條件下迅速取出脾臟，放入盛有RPMI1640培養(yǎng)

46、液的平皿中（冰?。?，剪碎，用注射器針芯搗爛，過(guò)100目鋼篩，制成脾細(xì)胞懸液。 （2）用培養(yǎng)液離心洗滌脾細(xì)胞3次，用臺(tái)盼藍(lán)檢查活細(xì)胞數(shù)在95％以上。將細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋成2×106個(gè)/ml。,70,（3）將脾細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，3～4復(fù)孔（也可更多）。加入有絲分裂原，培養(yǎng)72h。 （4）終止前6h，每孔加入3H-TdR 1ml，使其終濃度為1～5μci/ml。 （5）用微量多頭細(xì)胞收集儀，將細(xì)胞抽吸在49型

47、玻璃纖維濾紙上，置80℃烘箱內(nèi)干燥30min。 （6）將烘干的濾紙片放入盛有閃爍液的小瓶中，用液閃儀測(cè)定樣品中的放射強(qiáng)度（cpm）。,,72,【注意事項(xiàng)】 （1）無(wú)菌操作。 （2）脾細(xì)胞制備要放在冰浴中，避免細(xì)胞死亡帶來(lái)誤差。 （3）中藥粗制劑中影響因素較多，注意假陽(yáng)性。【評(píng)價(jià)】（1）3H-TdR摻入法客觀準(zhǔn)確。經(jīng)典方法。（2）可直接觀察藥物本身對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，也可觀察與有絲分裂原的協(xié)同or拮抗作用。,73,MTT

48、法：【基本原理】 Mosmann等根據(jù)細(xì)胞內(nèi)能量代謝水平與DNA合成水平平行相關(guān)，首創(chuàng)了四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法。MTT進(jìn)入細(xì)胞后作為反應(yīng)底物，被氧化成藍(lán)色的甲臜（formazan），存積于細(xì)胞內(nèi)及周圍，加入DMSO，使細(xì)胞破裂，并使細(xì)胞內(nèi)甲臜釋放出來(lái)，測(cè)定OD490nm。,74,（二）二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH反應(yīng)【基本原理】 DNFB是一種半抗原，將其溶液涂抹腹部皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺

49、激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。4~7天后將其再次涂抹皮膚，可使局部產(chǎn)生DTH反應(yīng)，一般在抗原攻擊24~48h達(dá)高峰，故此時(shí)測(cè)定局部腫脹。,75,【操作步驟】 （1）致敏：小鼠，隨機(jī)分組，腹部去毛，范圍約3×3cm2，并將1％DNFB溶液均勻涂抹于腹部皮膚，必要時(shí)于次日再?gòu)?qiáng)化一次。 （2）DTH反應(yīng)產(chǎn)生與測(cè)定：致敏后第5天，將1％DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊，對(duì)照組同樣涂耳但未致敏。,76,攻

50、擊24h后，脫頸處死小鼠，用直徑8mm的打孔器打下圓形耳片，稱重，以左右耳片總量之差為腫脹度；同時(shí)取小鼠胸腺及脾臟稱重，計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)（以每10g體重計(jì)）?！咀⒁馐马?xiàng)】 （1）DNFB溶液要臨用前新鮮配制。 （2）在小鼠腹部應(yīng)盡量去毛，且應(yīng)避免剪破皮膚。 （3）操作者避免DNFB與皮膚接觸。實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制在20±2℃為宜。,小 結(jié)一、影響非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)（一）碳粒廓清法/吞噬雞紅細(xì)胞法/化學(xué)發(fā)光測(cè)

51、定法(巨噬細(xì)胞)（二）溶菌酶測(cè)定法（三）硝類蘭四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)(中性粒細(xì)胞)（四）NK細(xì)胞活性檢測(cè),LDH法二、影響體液免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）血清溶血素測(cè)定法（二）抗體形成細(xì)胞測(cè)定法（PFC）（三）抗體水平的檢測(cè)三、影響細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（二）DTH反應(yīng)（三）細(xì)胞因子測(cè)定（四）細(xì)胞亞群檢測(cè),78,常用免疫學(xué)技術(shù)免疫沉淀 利用抗原抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一

52、種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶聯(lián)的agaose或Sepharose珠子孵育，通過(guò)離心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗體－目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)洗滌后，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。,79,2.免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)基本原理是將蛋白質(zhì)先行電泳分帶，然后將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用標(biāo)記信號(hào)分子（同位素、酶、熒光）的

53、抗體進(jìn)行結(jié)果判定。 Western blot,81,3.免疫組織化學(xué)技術(shù),應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。,83,4.細(xì)胞因子的測(cè)定1）m

54、RNA的表達(dá)水平 RT-PCR，real-time PCR2）生物活性測(cè)定法 IL-2，CTLL-2細(xì)胞株3）酶聯(lián)免疫測(cè)定法 ELISA4）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定 流式細(xì)胞術(shù) 5）蛋白質(zhì)芯片技術(shù),,84,ELISA （Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） 基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直

55、接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。,ELISA的原理,85,ELISA的類型,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"immunosorbent；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。,Example TGF-?1,,8

56、9,流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。該技術(shù)是一項(xiàng)集激光技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技細(xì)胞分析技術(shù)。概括地說(shuō)，流式細(xì)胞技術(shù)是通過(guò)流式細(xì)胞儀(flowcytometer)對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速和準(zhǔn)確地定量分析和分選。流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用十分廣泛。凡能被熒光分子標(biāo)記的

57、細(xì)胞或微粒均能用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。,90,CD3+CD8-IL-17+ Th17anti-CD3-FITC，anti-CD8-PE，anti-IL-17-APC,Control,Depression,0.3,0.5,,91,CD3+CD4+ cellsanti-CD3-FITC，anti-CD4-Percp-cy5,,92,5.淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)、分選 細(xì)胞表面標(biāo)志 1）流式細(xì)胞儀 2）