缺氧誘導(dǎo)因子1α在食管鱗癌發(fā)病機(jī)制中的研究.pdf

1、缺氧誘導(dǎo)因子1α在食管鱗癌發(fā)病機(jī)制中的研究研究生：施瑞華導(dǎo)師：范欽和南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究背景：缺氧誘導(dǎo)因子是一類由異源二聚體組成的轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體對(duì)缺氧適應(yīng)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是其亞型之一，缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)，介導(dǎo)缺氧反應(yīng)基因(HRG)的調(diào)控，產(chǎn)生生理效應(yīng)。缺氧誘導(dǎo)因子-1 α(HIF-1α)為HIF-1的氧調(diào)節(jié)亞單位，是其活性調(diào)節(jié)中心。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在大多數(shù)惡性腫瘤中存在表

2、達(dá)，可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等表達(dá)誘導(dǎo)血管生成，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展。 目的： 1、觀察HIF-1α、VEGF在食管癌患者發(fā)生、發(fā)展不同階段中表達(dá)變化及其與微血管密度(MVD)和腫瘤臨床病理特征間的相關(guān)性。 2、觀察缺氧狀態(tài)下HIF-1α、VEGF在食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109中的表達(dá)變化。 3、觀察HIF-1 α基因表達(dá)調(diào)控對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 4、通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，探

3、討HIF-1α基因表達(dá)調(diào)控對(duì)食管鱗癌生長(zhǎng)、侵襲等行為的影響。 方法： 1、采用免疫組化和原位雜交方法檢測(cè)42例食管正常上皮、40例食管鱗狀上皮不典型增生和67例食管鱗癌組織中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，分析在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展不同階段HIF-1α、VEGF表達(dá)變化；以CD3 1作為微血管密度(MVD)指標(biāo)，分析(1)HIF-1α、VEGF表達(dá)與MVD的相關(guān)性；(2)HIF-1α、VEGF和MVD與腫瘤臨床

4、病理特征的相關(guān)性。 2、在正常氧分壓和低氧條件下Eca-109細(xì)胞傳代培養(yǎng)，采用RT-PCR和Westem-Blot方法檢測(cè)HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)變化。 3、利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCsi-H1-shHIF轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞：(1)通過(guò)RT-PCR及Western Blot觀察HIF-1 α基因沉默后Eca-109細(xì)胞株中HIF-1α、VEGF、HO-1、MMP-2、PTEN表達(dá)；(2)流式細(xì)胞儀

5、分析HIF-1α基因沉默后Eca-109細(xì)胞生長(zhǎng)變化；(3)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察其增殖活力改變。 4、HIF-1α基因沉默后Eca-109細(xì)胞株和普通Eca-109細(xì)胞株植入裸鼠體內(nèi)，對(duì)比觀察移植瘤生長(zhǎng)情況。 結(jié)果： 1、在食管正常鱗狀上皮-不典型增生上皮-鱗癌組織中HIF-lα、VEGF在mRNA和蛋白水平表達(dá)呈逐步升高趨勢(shì)，MVD值顯著增加，組間差異明顯；鱗癌組織HIF-1α蛋白表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且

6、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)與MVD值呈正相關(guān)；鱗癌中HIF-lα、VEGF蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期正相關(guān)。 2、Eca-109細(xì)胞中HIF-1α mRNA水平在缺氧組較正常氧組明顯升高；VEGF mRNA的表達(dá)水平與王HIF-1αmRNA表達(dá)一致；HIF-1α蛋白水平在缺氧狀態(tài)下與正常氧狀態(tài)下相比無(wú)顯著差異。無(wú)論在正常氧還是缺氧狀態(tài)下HIF-1α蛋白的表達(dá)均存在磷酸化及去磷酸化兩種形式。 3、p

7、GCsi-H1-shHIF成功轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，有效抑制HIF-1 α基因表達(dá)并穩(wěn)定傳代；伴隨HIF-1α基因沉默同時(shí)出現(xiàn)VEGF、HO-1、MMF-2、PTEN的蛋白表達(dá)均下降； HIF-1α基因沉默后Eca-109更多阻滯于G1/GO期，且細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組明顯低下。 4、HIF-1α基因沉默．Eca-109細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)較普通傳代Eca．109細(xì)胞移植瘤明顯緩慢，移植瘤中心出現(xiàn)明顯壞死，免疫組化提示移植瘤內(nèi)HI

8、F-1 α、VEGF、MVD顯著減少。 結(jié)論： 1、食管鱗癌發(fā)生過(guò)程中HIF-1α、VEGF表達(dá)和MVD增加，HIF-1α可能通過(guò)誘導(dǎo)vEGF表達(dá)、促進(jìn)腫瘤血管生成而在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；食管鱗癌中HIF-1 α、VEGF高表達(dá)，提示兩者有可能成為評(píng)價(jià)腫瘤惡性程度的指標(biāo)。 2、缺氧狀態(tài)下HIF-1α在食管鱗癌細(xì)胞Eca-109中有過(guò)表達(dá)，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)伴有VEGF mRNA的表達(dá)增加。而缺氧

9、時(shí)HIF-1 α蛋白的表達(dá)水平雖然有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HIF-1α蛋白在缺氧狀態(tài)下的調(diào)節(jié)機(jī)制可能發(fā)生在翻譯后修飾水平。 3、重組質(zhì)粒pGCsi-H1-shHIF轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞后能有效抑制其HIF-1α基因的表達(dá)，導(dǎo)致Eca-109細(xì)胞增殖活力下降，多被阻滯于G1/GO期，提示HIF-1α可影響腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制合成。HIF-1α上游基因PTEN在HIF-1 α基因表達(dá)受抑后也出現(xiàn)了一定程度的抑制，這表明在調(diào)控通路中