缺氧誘導(dǎo)因子2α在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)意義及其分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　1.研究缺氧誘導(dǎo)因子2α(hypoxia inducible factor2α,HIF-2α)在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)簡(jiǎn)稱肝癌患者腫瘤組織及血清中的表達(dá)，探討HIF-2α的表達(dá)與患者臨床病理因素、預(yù)后及血管生成之間的關(guān)系，探討血清中HIF-2α蛋白對(duì)于肝癌的診斷價(jià)值。
　　2.研究普通培養(yǎng)及氯化鈷模擬缺氧培養(yǎng)條件下人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H、Hep3B、HepG

2、2、HCCLM3、Huh-7和人肝細(xì)胞HL-7702中HIF-2αmRNA及蛋白表達(dá)水平，并篩選合適細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)研究。
　　3.研究RNA干擾HIF-2α基因表達(dá)后肝癌細(xì)胞功能學(xué)改變。
　　4.探討HIF-2α基因在肝癌中的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.收集具有完整病例及隨訪資料的90例患者肝癌組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌組織中HIF-2α和血管生成相關(guān)指標(biāo)VEGF、CD34的表達(dá)，探討HIF-2α的

3、表達(dá)與患者臨床病理因素、血管生成及生存預(yù)后的關(guān)系。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)患者術(shù)前血清中HIF-2α的表達(dá)，受試者工作曲線(Receiver operating characteristics,ROC)分析比較HIF-2α和血清AFP值單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)肝癌的診斷價(jià)值。
　　2.對(duì)人肝癌細(xì)胞株 MHCC97H、HepG2、HCCLM3、Hep3B、Huh-7以及人肝細(xì)胞HL-7702進(jìn)行普通培養(yǎng)和氯化鈷模擬缺氧培養(yǎng)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光

4、定量PCR技術(shù)和Western blot法檢測(cè)各細(xì)胞株普通培養(yǎng)及缺氧模擬情況下HIF-2αmRNA及蛋白表達(dá)情況，并選取合適細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.HIF-2α特異性siRNA慢病毒感染人肝癌細(xì)胞株，使用RT-PCR檢測(cè)RNA干擾的有效性，確定siRNA干擾HIF-2α表達(dá)有效后進(jìn)行細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲實(shí)驗(yàn)，初步探討HIF-2α在肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等方面的作用。
　　4.采用affymetrix基因芯片檢測(cè)人

5、肝癌細(xì)胞HIF-2α基因表達(dá)下調(diào)后，全基因表達(dá)譜的變化，并應(yīng)用T檢驗(yàn)，找到成對(duì)樣本間的差異基因列表，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行pathway注釋，和GO分析即對(duì)差異基因進(jìn)行biological process、molecular function以及cellular component注釋，對(duì)相關(guān)基因和信號(hào)通路進(jìn)行綜合分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.90例肝癌組織中HIF-2α陽性者69例(76.7％)，顯著高于癌旁組

6、織(11/90,12.2%)，且HIF-2α高表達(dá)的患者血管浸潤(rùn)發(fā)生率高、腫瘤包膜多不完整、腫瘤TNM分期晚以及病理Edmondson分級(jí)高。HIF-2α的表達(dá)與腫瘤血管生成重要的促進(jìn)因子VEGF的表達(dá)呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(p<0.001)，且與肝癌組織中微血管密度(microvessel density,MVD)呈正相關(guān)(p<0.001)，提示HIF-2α可能促進(jìn)肝癌血管生成。HIF-2α陽性表達(dá)的患者預(yù)后無復(fù)發(fā)生存期DFS(p<0.001

7、)和總生存期OS(p<0.001)均較陰性者差，多因素分析，HIF-2α高表達(dá)的患者的OS(p=0.030)和DFS(p=0.005)均顯著低于HIF-2α陰性表達(dá)者。肝癌患者術(shù)前血清中HIF-2α水平明顯增高，且其表達(dá)與血管浸潤(rùn)、腫瘤包膜、腫瘤TNM分期、病理Edmondson分級(jí)以及肝硬化程度相關(guān)，ROC曲線分析提示HIF-2α聯(lián)合AFP可提高肝癌檢出率。
　　2.各肝癌細(xì)胞株和人肝細(xì)胞株缺氧培養(yǎng)較普通培養(yǎng)HIF-2αmRNA

8、表達(dá)水平無明顯差異，而普通培養(yǎng)時(shí)蛋白水平普遍較低，缺氧培養(yǎng)時(shí)則呈不同程度升高，人肝癌細(xì)胞株Hep3B升高最顯著，故用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.siRNA慢病毒感染Hep3B細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示HIF-2α基因表達(dá)顯著下調(diào)，MTT測(cè)定siRNA干擾組肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于對(duì)照組；Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示siRNA干擾組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加。
　　4.RNA干擾人肝癌細(xì)胞株Hep3B中HI

9、F-2α表達(dá)后，基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)差異表達(dá)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1352個(gè)基因表達(dá)發(fā)生明顯改變，其中上調(diào)674個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為678個(gè)。差異基因主要涉及30個(gè)信號(hào)通路，包括MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、Notch信號(hào)通路等重要信號(hào)調(diào)節(jié)通路。
　　結(jié)論
　　1.人肝癌組織中HIF-2α高表達(dá)，其表達(dá)與血管浸潤(rùn)、腫瘤包膜、TNM分期以及病理分級(jí)相關(guān)；HIF-2α的表達(dá)與腫瘤血管生成密切相關(guān)，可作為肝癌患者術(shù)后預(yù)后預(yù)測(cè)的獨(dú)

10、立危險(xiǎn)因素；聯(lián)合血清HIF-2α和AFP檢測(cè)可提高肝癌檢出率；HIF-2α可能作為肝癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在分子標(biāo)記物。
　　2.缺氧培養(yǎng)條件下人肝癌細(xì)胞株和人肝細(xì)胞株HIF-2α的mRNA表達(dá)水平較普通培養(yǎng)無明顯改變，蛋白水平則不同程度提高，進(jìn)一步證實(shí)了HIF-2α的表達(dá)是受氧依賴的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，并篩選出人肝癌細(xì)胞株Hep3B用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.RNA干擾技術(shù)成功下調(diào)了人肝癌細(xì)胞株Hep3B中HIF-2α基因的表