NOK基因在人腦膠質(zhì)細胞瘤增殖和侵襲中的作用及其機制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率約占全部顱內(nèi)腫瘤的40％；目前盡管腦膠質(zhì)細胞瘤的治療方法在不斷地改善和提高，但其治療仍然沒有顯著提高，而且患者預后較差，平均生存期還不到一年。治療困難的主要原因在于腦膠質(zhì)細胞瘤的惡性生物學特性；因此，為了進一步改善腦膠質(zhì)細胞瘤的治療效果，尋找和研究在腦膠質(zhì)細胞瘤的惡性進展中發(fā)揮重要作用的相關分子具有重要的科學意義和臨床應用價值。
　　NOK（NovelOncogenewithKi

2、nase-domain）基因是2004年從人扁桃體癌中克隆的一個新的癌基因（基因登錄號為GenebankAAT01226），屬于受體型酪氨酸蛋白激酶家族的一員。NOK基因組全長2.79kb，位于染色體12q13.2，mRNA全長1269bp，能夠編碼422個氨基酸，分子量約為47.6kD的蛋白質(zhì)。NOK基因廣泛高表達于多種腫瘤細胞和腫瘤組織，如肺癌（A549）、乳腺癌（MDA-MB-231）、急性髓系白血?。℉L-60、U937和K56

3、2）、卵巢癌（HS832、OvCar3和CaOv3）和前列腺癌（LNCaP）等；這些都預示著NOK蛋白可能對腫瘤生成有一定的調(diào)控作用。但是目前尚未有關NOK基因與腦膠質(zhì)細胞瘤相關性研究的報道。NOK分子能否成為有價值的腦膠質(zhì)細胞瘤治療的新靶點需要進一步的研究證實。
　　本課題系統(tǒng)地研究了NOK分子在腦膠質(zhì)細胞瘤中的表達特征，揭示了NOK分子在腦膠質(zhì)細胞瘤中的表達特征及其與腫瘤病理分級的關系；本研究還初步探討了NOK分子在不同表達水

4、平下對于腦膠質(zhì)瘤細胞體外增殖、侵襲、凋亡以及裸鼠致瘤性的影響，這些都有助于揭示NOK分子在腦膠質(zhì)細胞瘤惡性進展中所發(fā)揮的作用。本課題主要包括以下四方面研究：
　　1.NOK在人腦膠質(zhì)細胞瘤中的表達及意義
　　本研究首先從mRNA和蛋白水平研究了NOK分子在83例人腦膠質(zhì)細胞瘤組織、10例正常人腦組織以及3株人腦星形膠質(zhì)瘤細胞系（U251、BT325和U87）中的表達。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（Reverse-transcripti

5、onPCR，RT-PCR）和Westernblot研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOKmRNA和蛋白在U251和U87細胞中表達水平均較高，而BT325細胞中NOKmRNA和蛋白表達較低；在10例正常人腦組織中，只有1例檢測到NOKmRNA和蛋白表達，其余9例均未見NOK的表達；而NOKmRNA和蛋白在不同病理級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均有表達，并且其表達強度隨著臨床病理級別的增高，NOK的表達有增高的趨勢。本研究進一步采用免疫組織化學法檢測了NOK蛋白在人腦

6、膠質(zhì)細胞瘤組織和正常腦組織中的表達。結(jié)果提示：NOK蛋白陽性染色定位于胞漿和/或胞膜；在83例人腦膠質(zhì)細胞瘤標本中，57例標本表達檢測到NOK表達，表達陽性率為68.7％，而10例正常人腦組織中只有1例表達。在人腦膠質(zhì)細胞瘤及正常人腦組織中，NOK蛋白陽性表達率存在顯著差異（P<0.01）。并且，NOK蛋白表達陽性率隨著臨床病理級別的增高而顯著升高，在I～IV級腫瘤組織間差異顯著（P<0.05）；但是其與患者性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤的

7、發(fā)生部位無關（P均>0.05）。本部分研究結(jié)果表明，NOKmRNA和蛋白在腦膠質(zhì)細胞瘤組織和部分細胞系中高表達，其表達強度隨著腦膠質(zhì)細胞瘤病理級別的升高而增高。
　　2.NOK慢病毒表達載體及慢病毒干涉載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細胞系的研究
　　根據(jù)NOK的cDNA全長特點，設計了PCR引物，成功的從獲贈真核表達載體pcDNA3.1-NOK中獲得了NOK的cDNA全長，將其克隆入Gateway系統(tǒng)中入門克隆載體pENTR/3C中，重

8、組體pENTR/3C-NOK酶切、PCR和測序鑒定；然后利用重組反應（Gateway?LRClonase?Reaction），將pENTR/3C-NOK重組體中的NOK全長導入慢病毒載體pLenti-6.3/V5中，重組體pLenti-6.3/V5-NOK酶切、PCR鑒定和測序；pLenti-6.3/V5-NOK和對照質(zhì)粒pLenti-6.3/V5-cherry分別與輔助質(zhì)粒psPAX2,pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分別轉(zhuǎn)染

9、293T細胞進行病毒包裝。慢病毒感染BT325細胞，Blasticidin抗性篩選出穩(wěn)定細胞株分別命名為BT325-NOK和BT325-cherry細胞，RT-PCR和Westernblot法檢測穩(wěn)定細胞株中NOKmRNA和蛋白表達水平，結(jié)果顯示：與BT325-cherry細胞相比，BT325-NOK細胞中的NOKmRNA和蛋白表達水平顯著升高。
　　將購買兩個NOK慢病毒干涉載體（pLKO.1-NOK-1和pLKO.1-NOK-

10、2）及對照載體scramble分別與輔助質(zhì)粒psPAX2,pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分別轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝。慢病毒感染U251細胞，嘌呤霉素抗性篩選出穩(wěn)定細胞株分別命名為U251-sh1、U251-sh2和U251-control細胞，RT-PCR和Westernblot法檢測穩(wěn)定細胞株中NOKmRNA和蛋白表達水平，結(jié)果顯示：與U251-control細胞相比，U251-sh1和U251-sh2細胞中的NOKm

11、RNA和蛋白表達水平均受到明顯抑制。
　　本部分結(jié)果提示：成功構(gòu)建含有NOK全長的慢病毒表達載體，將該載體和NOK慢病毒干涉載體分別進行病毒包裝，分別感染腦膠質(zhì)瘤細胞系，成功的建立了上調(diào)或抑制NOKmRNA和蛋白表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，為下一步研究NOK分子在調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細胞生物學特性中的作用提供了良好的細胞模型。
　　3.上調(diào)或抑制NOK基因的表達對人腦膠質(zhì)瘤細胞生物學特性的影響
　　本部分針對已經(jīng)建立的兩組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系（U

12、251-sh1、U251-sh2、U251-control和BT325-NOK、BT325-cherry）進行實驗研究。首先觀察了NOK基因?qū)δz質(zhì)瘤細胞增殖和細胞周期的影響；MTT繪制生長曲線顯示：與U251-control細胞相比，U251-sh1和U251-sh2細胞生長、增殖均受到明顯抑制（P<0.05）；BT325-NOK細胞的增殖明顯增快，顯著高于BT325-cherry細胞（P<0.01）。平板克隆形成實驗和軟瓊脂集落形成實

13、驗用來測定細胞克隆形成數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：U251-sh1和U251-sh2細胞增殖數(shù)和克隆形成數(shù)均明顯低于其對照組（P<0.01）；BT325-NOK細胞增殖數(shù)和克隆形成數(shù)則顯著高于其對照組（P<0.01）。流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)：與U251-control細胞相比，U251-sh1和U251-sh2兩組細胞的G1期細胞均明顯增加（P<0.01），G2/M期細胞均明顯減少（P<0.01），發(fā)生了G1期阻滯；與對照組BT325-

14、cherry細胞相比，BT325-NOK細胞的G0/G1期細胞明顯減少（P<0.01），S期細胞顯著增多（P<0.01），G2/M期細胞略有增多。其次我們運用劃痕實驗和Transwell侵襲小室法觀察了NOK基因?qū)δz質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)：U251-sh1和U251-sh2兩組細胞的遷移能力均明顯低于其對照組（P<0.01），而且在Transwell實驗中，U251-sh1和U251-sh2兩組細胞穿過Matrigel的細胞

15、數(shù)也均明顯低于其對照組（P<0.01）；與BT325-cherry細胞相比，BT325-NOK細胞的遷移和侵襲能力均明顯增加（P<0.01）。
　　本部分研究結(jié)果表明，NOK基因可能在調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤細胞的體外增殖和侵襲等惡性生物學特性中發(fā)揮重要作用。
　　4.NOK基因RNAi對人腦膠質(zhì)瘤細胞裸鼠體內(nèi)成瘤、增殖以及侵襲的影響本部分研究U251-control、U251-sh1和U251-sh2三種細胞分別接種于裸鼠背部皮下，

16、定期測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察其在裸鼠體內(nèi)的成瘤性。共觀察了30天。Westernblot方法檢測移植瘤組織中NOK蛋白的表達情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：U251-sh1和U251-sh2兩組細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力和生長速度均明顯低于其對照組（P<0.01），腫瘤體積和重量也均明顯低于其對照組（P<0.01）；結(jié)果顯示與U251-control組相比，U251-sh1和U251-sh2組的腫瘤中NOK蛋白表達均明顯抑制（P<0.01