Sirt1調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在心腎綜合征病理生理過程中作用機制的研究.pdf

1、研究目的:
　　研究Sirt1在雙腎次全切除術(shù)(Subtotal Nephrectomy，STNx)聯(lián)合前降支結(jié)扎致心肌梗死(Myocardial infarction，MI)法建立的慢性心腎綜合征小鼠模型中對心、腎結(jié)構(gòu)、功能的影響及其參與調(diào)控的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制。
　　研究內(nèi)容:
　　本研究將主要研究(1)通過雙腎次全切除術(shù)建立單純腎臟病變模型(STNx)觀察單純腎臟病變對心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響;(2)與正常腎臟結(jié)構(gòu)功能(

2、ShamSTNx)相比較，伴有腎臟病變時心肌梗死后心肌重構(gòu)及病理生理出現(xiàn)的變化;(3)心臟特異性Sirt1敲除(Sirt1 CKO)后是否加重腎臟病變對心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)、功能的影響以及心肌重構(gòu)的進一步加重;(4)進一步探討心臟特異性Sirt1過表達(Tg Sirt1)對伴有或不伴有腎臟病變時心肌梗死后心肌重構(gòu)是否具有保護作用。
　　研究方法:
　　我們以C57BL/6小鼠為研究對象，采用雙腎次全切除術(shù)聯(lián)合前降支結(jié)扎法建立慢

3、性心腎綜合征動物模型。首先研究單純腎臟病變對心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，并與正常腎臟結(jié)構(gòu)功能組相比較，觀察伴有腎臟病變時心肌梗死后心肌重構(gòu)及病理生理出現(xiàn)的變化。本部分實驗方案如下:
　　Protoco11:(1)對照組(Contro1):WT Sham STNx+Sham MI，即為假雙腎次全切除術(shù)和假冠脈結(jié)扎術(shù)的野生型小鼠;(2) WT MI組:wr ShamSTNx+MI，即僅給予假雙腎次全切除術(shù)和冠脈結(jié)扎的野生型小鼠;(3) WT

4、MI+ STNx組，野生型小鼠先后給予STNx和MI。
　　接下來我們對小鼠實施心臟Sirt1條件性基因敲除(Sirt1 CKO)，觀察心臟特異性Sirt1敲除后是否加重腎臟病變對心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)、功能的影響以及心肌重構(gòu)的進一步加重。本部分實驗方案如下:
　　Protocol2:(1)對照組（Cre+/-Sirt1+/+ Sham STNx+Sham MI），對照組小鼠先后行假雙腎次全切除和假心梗術(shù);(2)對照組單純心肌梗

5、死組（Cre+/-Sirt1+/+ Sham STNx+MI），對照組小鼠行假腎次全切除和心梗術(shù);(3)對照組雙腎次全切除術(shù)聯(lián)合心肌梗死組(Cre+/-Sirt1+／+STNx+MI)，對照組小鼠先后行雙腎次全切除術(shù)和心梗術(shù);(4)單純Sirt1敲除組(Sirt1 CKO ShamSTNx+Sham MI)，心臟特異性Sirt1敲除小鼠先后行假腎次全切除術(shù)和假心梗術(shù);(5) Sirt1敲除單純心肌梗死組(Sirt1 CKO Sham S

6、TNx+MI)，心臟特異性Sirt1敲除小鼠行假雙腎次全切除術(shù)和心梗術(shù);(6) Sirt1敲除雙腎次全切除術(shù)及心肌梗死組(Sirt1 CKO STNx+MI)，心臟特異性Sirt1敲除小鼠先后行雙腎次全切除術(shù)和心梗術(shù)。
　　最后，我們對小鼠心肌組織采用微注射Sirt1慢病毒的方法建立心臟特異性過表達(Tg Sirt1)動物模型，觀察對伴有或不伴有腎臟病變時心肌梗死后心肌重構(gòu)是否具有保護作用。本部分采實驗方案如下:
　　Pro

7、tocol3:(1)對照組心肌內(nèi)微注射空載病毒(NTg Sirt1 Sham STNx+Sham MI)，對照組小鼠先后行假雙腎次全切除術(shù)和假心梗術(shù);(2)對照組單純心肌梗死組(NTg Sirt1 Sham STNx+MI)，對照組小鼠先后行假雙腎次全切除術(shù)和心梗術(shù);(3)對照組雙腎次全切除術(shù)聯(lián)合心肌梗死組(NTg Sirt1 STNx+MI)，對照組小鼠先后行雙腎次全切除術(shù)和心梗術(shù);(4)單純Sirt1過表達組(Tg Sirt1 Sh

8、am STNx+Sham MI)，心臟特異性Sirt1慢病毒微注射小鼠先后行假雙腎次全切除術(shù)和假心梗術(shù);(5) Sirt1過表達單純心肌梗死組(Tg Sirt1Sham STNx+MI)，心臟特異性Sirt1過表達小鼠先后行假雙腎次全切除術(shù)和心梗術(shù);(6)Sirt1過表達雙腎次全切除術(shù)聯(lián)合心肌梗死組(Tg Sirt1 STNx+MI)，心臟特異性Sirt1過表達小鼠先后行雙腎次全切除術(shù)和心梗術(shù)。
　　以上動物按照分組分別進行相應手

9、術(shù)前后觀察，術(shù)前及術(shù)后收集24h尿液，術(shù)后8周分別評估心、腎功能水平。最后我們分別采用ELISA法檢測小鼠血液BUN、Scr、BNP、尿液蛋白肌酐比值(UACR)，采用Western blot檢測心、腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)相關(guān)蛋白的表達，以探討Sirt1在參與本慢性心腎綜合征疾病模型病理生理過程中的相關(guān)機制。
　　研究結(jié)果:
　　(1)雙腎次全切除術(shù)后腎小球發(fā)生

10、腫脹，出現(xiàn)分葉樣改變，腎小球內(nèi)細胞數(shù)量及體積增加，系膜基質(zhì)增生，足細胞損傷加重，血BUN、Scr輕度增高，尿蛋白/肌酐比值(UACR)顯著升高，腎功能惡化。但是單純雙腎次全切除術(shù)后小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能未出現(xiàn)顯著變化。
　　(2)結(jié)扎前降支建立心肌梗死模型4周后出現(xiàn)心肌重構(gòu)和心臟功能惡化，表現(xiàn)為心臟擴大，射血分數(shù)降低，伴隨BNP水平顯著升高。與對照組相比較，單純心肌梗死本身并未對腎臟的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生顯著影響。
　　(3)與正常腎

11、臟結(jié)構(gòu)功能組相比較，伴有腎臟病變時心肌梗死后表現(xiàn)為心臟擴大、心肌重構(gòu)明顯加重，心功能顯著降低（EF值），BNP水平顯著升高，纖維化程度加重，與此同時腎小球、基底膜損傷和纖維化加劇，腎臟功能也較對照組明顯加重，這說明雙腎次全切除術(shù)所致的腎臟病變在本模型中參與了心腎綜合征的產(chǎn)生和進展過程，促進了心腎綜合征的發(fā)生與發(fā)展。
　　(4)與同窩對照小鼠相同手術(shù)處理的對照組相比較，心臟特異性Sirt1基因敲除后加重了腎臟病變對心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)

12、重構(gòu)和功能的影響，心、腎結(jié)構(gòu)功能進一步加重。表現(xiàn)為小鼠心臟擴大和射血功能減退最為顯著，腎功能惡化。而此時心臟特異性Sirt1過表達對伴有或不伴有腎臟病變時心肌梗死后心、腎結(jié)構(gòu)和功能都具有保護作用。
　　(5)與同窩對照小鼠相同手術(shù)處理組相比較，心臟特異性Sirt1基因敲除后雙腎次全切除術(shù)聯(lián)合心肌梗死組小鼠心臟組織的CHOP和GRP78水平顯著增高，與此同時，小鼠腎臟組織GRP78、Bax和p53表達也顯著升高。而心臟特異性Sirt