內質網應激在糖尿病誘發(fā)血管損傷過程中的作用機制研究.pdf

1、背景：流行病學研究表明，糖尿病患者的心血管并發(fā)癥成為其最常見的致死和致殘原因。糖尿?。―iabetes mellitus，DM）能夠引起血管功能紊亂，并最終發(fā)展為高血壓，但其具體的作用機制尚不明確。有研究報道內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS)廣泛存在于糖尿病患者體內的多種組織和器官，并與代謝性疾病密切相關。近期發(fā)現(xiàn)ERS在心血管疾病，包括糖尿病心血管并發(fā)癥、動脈粥樣硬化及心力衰竭的發(fā)病過程中發(fā)

2、揮重要作用。那么，ERS是否是連接高血糖和糖尿性血管功能紊亂的樞紐成為本研究關注的重點。本課題以高血糖動物的小血管為研究對象，旨在對高血糖誘發(fā)血管損傷的分子機制進行探討，并觀察微血管內質網應激在糖尿病誘發(fā)血管損傷過程所發(fā)揮的作用。
　　方法：本研究建造兩種大鼠模型：1）領取12周齡SD雄性大鼠，隨機分為2組：①按照35 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）誘導高血糖模型，選擇血糖水平持續(xù)高于16.

3、7 mM且低于26.0 mM的動物作為糖尿病組（STZ）；②腹腔注射等體積溶媒（檸檬酸鹽緩沖液）作為對照組（Control, Con）。成模后1個月以無創(chuàng)尾動脈血壓測定法檢測血壓，期間監(jiān)測大鼠體質量和隨機血糖。血壓檢測完畢后處死，取大鼠腸系膜阻力血管（mesenteric resistant arteries，MRA），采用蛋白印跡法（Western blotting）測定胰島素信號通路關鍵因子蛋白激酶B(protein kinase

4、B, Akt/PKB)及胰島素受體底物1(insulin receptor substrate1, IRS1)及內皮型一氧化氮合酶（ endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的蛋白質表達水平；實時熒光定量PCR（RT-PCR）測定大鼠 MRA中內質網應激相關因子葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)、RNA依賴的蛋白激酶R樣內質網激酶（RNA-d

5、ependent protein kinase R-like ER kinase, PERK）、真核翻譯起始因子2α（eukaryotic initiation factor2α, eif2α)、X盒結合蛋白1（X-box binding proteinⅠ, Xbp-1)、轉錄激活因子6（activating transcription factor6, ATF6)、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-bi

6、nding protein homologous protein, CHOP）的基因轉錄水平；及ERS標志物葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein, GRP78)的蛋白表達水平。2）高血糖雄性大鼠與正常雌鼠交配，其子鼠為實驗組（offspring of diabetes mellitus, DM-O）,正常雄性大鼠與正常雌鼠交配，其子鼠為對照組（offspring of Control, Con-O）。兩

7、組子鼠出生后監(jiān)測體重、隨機血糖和空腹血糖；實施葡萄糖耐量實驗；檢測血壓。給予內質網應激抑制劑4-苯基丁酸（4-Phenylbutyrate acid,4-PBA）灌胃處理1個月后處死動物，收集MRA和肝臟組織。Western blotting測定內質網應激相關蛋白的表達水平；IRS1、Akt及eNOS的蛋白質表達水平及其磷酸化水平。肝臟組織進行透射電子顯微鏡觀測。
　　結果：1）與對照組相比，糖尿病大鼠血糖水平顯著升高，體質量明顯

8、下降，收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均明顯升高。Western blotting結果表明胰島素信號通路關鍵因子 IRS1、Akt的磷酸化水平均顯著下降；影響血管舒縮功能的eNOS磷酸化水平顯著低于對照組，總eNOS蛋白表達水平不變；ERS標志物GRP78/Bip蛋白表達水平顯著升高。RT-PCR結果顯示糖尿病大鼠MRA中內質網應激相關因子的基因表達水平顯著升高。2）糖尿病組子代體重明顯增加，葡萄糖耐量受損。透射電鏡觀察到糖尿病組子代肝臟細胞