SIRT1的選擇性剪接在衰老過程中的作用研究.pdf

1、衰老是生物體內(nèi)發(fā)生的漸進(jìn)性多器官、多層次、多方面的復(fù)雜變化過程，其后果是機(jī)體功能的衰退或失調(diào)。機(jī)體衰老的基礎(chǔ)是細(xì)胞的衰老，這一過程受遺傳和環(huán)境因素的共同調(diào)節(jié)。目前，雖然有多種學(xué)說從不同方面解釋衰老的發(fā)生，但其關(guān)鍵機(jī)制以及調(diào)控方式仍不明確。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源物1(Silent mating type information regulation2 homolog1，SIRT1)是一個NAD+依賴的組蛋白脫乙?；?，經(jīng)其去乙

2、?；饔糜绊慞53，P16， FOXO，NF-κB，和 PGC-1α等不同的下游分子，進(jìn)而對細(xì)胞的衰老、程序性死亡、新陳代謝等不同過程進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在熱量限制（Caloric restriction，CR）引起的生命周期的延長中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，從而引發(fā)了研究者的廣泛興趣。在體外， SIRT1能夠抑制氧化應(yīng)激和高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞以及干細(xì)胞的衰老；在嚙齒類動物的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，SIRT1在衰老過程以及年齡依賴的器官功能下降中發(fā)

3、揮重要作用。然而SIRT1對部分下游分子，甚至生理或病理進(jìn)程的作用研究常常存在相互矛盾的報道。這提示SIRT1的功能可能存在更加復(fù)雜的機(jī)制和調(diào)控因素。
　　SIRT1的序列高度保守，且長期被認(rèn)為不存在剪接變異體。但2010年Lynch等的研究顯示人類及小鼠的SIRT1 pre-mRNA存在選擇性剪接，即產(chǎn)生缺失第八外顯子的SIRT1（SIRT1-ΔExon8）和SIRT1全長（SIRT1-FL）兩種變異體。新近研究發(fā)現(xiàn)， SIRT

4、1-ΔExon8的生物學(xué)作用及調(diào)控機(jī)制與SIRT1-FL存在較大差異。在前期的實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)可能也存在 SIRT1的選擇性剪接，由于大鼠與人和小鼠的SIRT1結(jié)構(gòu)不同，后者具有9個外顯子，而大鼠具有8個外顯子，因此其產(chǎn)生的選擇性變異體也不同。實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠可能產(chǎn)生與小鼠或人SIRT1-ΔExon8的生物學(xué)作用與調(diào)控機(jī)制相似的缺失第七外顯子的SIRT1（SIRT1-ΔExon7）。已知SIRT1在衰老進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，但

5、其剪接變異體是否影響衰老進(jìn)程目前尚無報道。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用衰老的細(xì)胞模型和動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠的選擇性剪接，以及觀察大鼠SIRT1的選擇性剪接在衰老過程可能發(fā)揮的作用。
　　第一部分 SIRT1-ΔExon8在D-半乳糖誘導(dǎo)的293T細(xì)胞衰老模型中的作用觀察
　　目的：
　　通過觀察缺失第八外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體（SIRT1-ΔExon8）在D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)的293T細(xì)胞衰老模型中的表

6、達(dá)變化，初步探討SIRT1-ΔExon8對細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響。
　　方法：
　　1.CCK8法測定不同濃度D-半乳糖（0，5，10，15，20 g/L）對293T細(xì)胞活力的影響。2.選取終濃度為10 g/L的D-半乳糖DMEM高糖培養(yǎng)基作用于第3代293T細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至第6代，建立細(xì)胞衰老模型，應(yīng)用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色方法觀察衰老細(xì)胞的陽性率。3.RT-PCR檢測誘導(dǎo)組與對照組細(xì)胞中SIRT1-F

7、L及SIRT1-ΔExon8 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8結(jié)果顯示10 g/L的D-半乳糖培養(yǎng)基能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老且不引起細(xì)胞過度損傷。2.誘導(dǎo)組衰老細(xì)胞陽性率74.25±3.62％高于對照組7.68±1.43%（P<0.05）。3. RT- PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8 mRNA表達(dá)水平分別較對照組降低了78.26±5.16%和88.03±3.27%（P<0.05）。<

8、br>　　小結(jié)：
　　1. SA-β-gal染色結(jié)果提示D-半乳糖誘導(dǎo)的293T細(xì)胞衰老模型建立成功。2.衰老細(xì)胞組的SIRT1-FL以及SIRT1-ΔExon8 mRNA表達(dá)水平較對照組均顯著降低，提示SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8可能參與調(diào)控細(xì)胞衰老進(jìn)程。
　　第二部分 SIRT1-ΔExon7在大鼠衰老過程中的表達(dá)改變及意義
　　目的：
　　證實(shí)大鼠海馬組織中存在 SIRT1的選擇性剪接變異體；

9、觀察 SIRT1全長及缺失第七外顯子的 SIRT1選擇性剪接變異體（SIRT1-ΔExon7）在不同年齡段大鼠海馬組織中表達(dá)變化，從而初步探討SIRT1全長及SIRT1-ΔExon7在衰老進(jìn)程中的表達(dá)改變。
　　方法：
　　1.通過 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳及 cDNA測序檢測擴(kuò)增目的基因是否為SIRT1-ΔExon7。2.將不同日齡(P7，P90，P720)大鼠海馬組織進(jìn)行冰凍切片，并應(yīng)用SA-β-gal染色并觀察細(xì)胞衰老陽性

10、率。3. RT-PCR測定不同年齡段大鼠海馬組織中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.瓊脂糖凝膠電泳及測序結(jié)果顯示，大鼠海馬組織存在SIRT1-ΔExon7的表達(dá)。2. SA-β-gal染色結(jié)果顯示新生鼠偶見SA-β-gal陽性衰老細(xì)胞，而老年大鼠可見大量胞漿呈淡藍(lán)色的SA-β-gal陽性衰老細(xì)胞，提示隨年齡增加大鼠腦內(nèi)細(xì)胞的SA-β-gal活性逐漸增強(qiáng)，衰老細(xì)胞呈年齡依賴性

11、遞增趨勢。3. RT- PCR結(jié)果顯示P90組及P720組SIRT1-FL mRNA表達(dá)水平與P7組相比均無明顯差異；而SIRT1-ΔExon7 mRNA表達(dá)水平分別升高了77.40±7.38%和89.28±9.23%（P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.大鼠體內(nèi)存在缺失第7外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體。2. SIRT1-ΔExon7在衰老海馬組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。
　　第三部分 SIRT1-ΔExon7在誘導(dǎo)大鼠

12、MSCs衰老細(xì)胞中的表達(dá)變化及意義
　　目的：
　　為了更進(jìn)一步研究SIRT1以及SIRT-Δ7在衰老過程的作用，我們采用誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）衰老細(xì)胞模型，觀察SIRT-Δ7在細(xì)胞衰老過程中的表達(dá)變化。
　　方法：
　　1.將MSCs細(xì)胞反復(fù)傳代至第18代，β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色觀察衰老細(xì)胞陽性率。2.RT-PCR檢測衰老組與對照組細(xì)胞

13、中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.隨著細(xì)胞不斷傳代 SA-β-gal陽性衰老細(xì)胞增加，衰老組細(xì)胞陽性率57.64%±7.39%明顯高于對照組16.35%±2.17%（P<0.05）。2. RT- PCR結(jié)果顯示衰老組SIRT1-FL mRNA表達(dá)水平較對照組降低了20.09±2.74%（P<0.05）；和SIRT1-ΔExon7 mRNA表達(dá)水平較對照組升高了132.85

14、±11.07%（P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　衰老細(xì)胞中SIRT1-ΔExon7表達(dá)顯著升高，提示SIRT1-ΔExon7可能在衰老過程發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：
　　1.首次證實(shí)大鼠存在 SIRT1的選擇性剪接，形成選擇性變異體 SIRT1-ΔExon7，而不是之前報道的SIRT1-ΔExon8。
　　2.整體動物及離體實(shí)驗(yàn)（兩種來源的細(xì)胞）均觀察到衰老過程中 SIRT1-ΔExon7表達(dá)水平的改變，提示