嗅鞘細(xì)胞移植對大鼠腦梗死慢性期影響.pdf

1、腦梗死后缺血中心區(qū)大量神經(jīng)元死亡，神經(jīng)軸突變性，造成嚴(yán)重功能障礙，殘留后遺癥。人們不斷嘗試各種神經(jīng)再生修復(fù)策略，但效果非常有限。中樞神經(jīng)再生修復(fù)能力低的主要原因是中樞神經(jīng)損傷后膠質(zhì)細(xì)胞增生瘢痕形成、神經(jīng)營養(yǎng)因子相對缺乏以及存在各種抑制神經(jīng)再生的因子。嗅鞘細(xì)胞(OECs)是一種非常獨(dú)特的細(xì)胞，有一定神經(jīng)再生“容許性”，能夠分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有促進(jìn)中樞神經(jīng)再生能力。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)OECs移植能促進(jìn)脊髓損傷神經(jīng)軸突再生和功能恢復(fù)。目前，O

2、ECs用于腦梗死干預(yù)策略研究少有報(bào)道。本研究建立培養(yǎng)、純化OECs方法，觀察環(huán)孢霉素A對OECs移植后在體內(nèi)存活、遷徙的影響，初步探討OECs聯(lián)合EBCs移植對大鼠腦梗死后神經(jīng)修復(fù)效果。 本文分兩部分。第一部分是關(guān)于：大鼠嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)、純化、鑒定及儲存；第二部分(一)慢性期腦梗死模型中環(huán)孢霉素A對移植嗅鞘細(xì)胞存活影響研究；第二部分(二)大鼠胚腦細(xì)胞與嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合移植治療慢性期腦梗死的實(shí)驗(yàn)研究。 材料與方法： 一、

3、OECs培養(yǎng)、純化和鑒定從新生7天SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠嗅球(olfactory Bulb)和嗅束(olfactory bundle)取材進(jìn)行OECs原代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)3N5天后用純化液繼續(xù)培養(yǎng)純化2～3天，經(jīng)p75、S100和GFAP免疫染色鑒定OECs純度。 二、動物實(shí)驗(yàn) 動物模型：選用體重350～400g雄性Sprague-Dawley大鼠，使用雙極電凝器電凝大腦中動脈，同時(shí)永久性結(jié)扎同側(cè)頸

4、總動脈制作腦梗死模型。 實(shí)驗(yàn)分組： 實(shí)驗(yàn)(一)免疫抑制劑對比研究實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)選取成功模型分為4組(A組，B組每組24只；C組，D組每組12只)，分為OECs移植組、OECs移植+環(huán)孢霉素A組(自移植前1天至取材腹腔注射，10 mg/kg/day)、培養(yǎng)基移植組和模型組； 實(shí)驗(yàn)(二)不同類型細(xì)胞移植效果對比研究實(shí)驗(yàn)：分為四組(每組15只)，A組，OEC移植組；B組，EBC移植組；C組，聯(lián)合移植組和對照組(D組)。其中

5、對照組均選擇移植達(dá)樂伯克改良培養(yǎng)基(DMEM)。細(xì)胞準(zhǔn)備：培養(yǎng)、純化方法同前，不同的是用于移植的細(xì)胞均來源于GFP(+)的SD大鼠。 細(xì)胞移植：隨機(jī)選擇腦梗死4W后的SD大鼠，將大鼠頭部固定于立體定位儀，參照Paxino和Watson大鼠圖譜行微量多點(diǎn)注射(三點(diǎn)三段)，注射點(diǎn)為梗死灶邊緣右側(cè)皮質(zhì)至紋狀體區(qū)域，以前囪為參考點(diǎn)，按照前囪尾側(cè)1mm、0mm、-1mm三點(diǎn)；中線旁開4.0mm；在深度為垂直距腦膜分別為4.5mm、3.0m

6、m、1.5mm三段上，移植組緩慢注入濃度為5×105/9μl或同體積DMEM/F-12，速度均為0.5μl/1 min，拔針前留置5分鐘以防溢出。 觀察：各組大鼠在移植術(shù)前及移植術(shù)后2W、4W、5W、7W、12W、15W、20W進(jìn)行行為功能檢查：參照神經(jīng)功能缺損實(shí)驗(yàn)評分標(biāo)準(zhǔn)和水迷宮試驗(yàn)評價(jià)運(yùn)動功能和認(rèn)知記憶功能，相應(yīng)時(shí)間段評分后每組隨機(jī)抽取3只大鼠處死，4％水合氯醛(400mg/kg)腹腔麻醉，快速取大腦，并制作冰凍切片，片厚為

7、20um，進(jìn)行HE染色、P75、S100、GFAP、MBP及NF等免疫組化染色。使用熒光顯微鏡觀察移植于體內(nèi)細(xì)胞存活、遷徙、成鞘、增殖等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。 主要結(jié)果與結(jié)論： 1.采用差異貼壁法進(jìn)行OECs純化培養(yǎng)可獲得較高純度OECs，免疫組化染色P75(47％)、S100(90％)、GFAP(93％)、SMA(33％)，細(xì)胞增長快，費(fèi)用低，簡單易行。 2.用開顱電凝MCA的方法制作慢性期腦梗死模型4周后可形成相對穩(wěn)定