嗅鞘細(xì)胞移植治療大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷的初步研究.pdf

1、終絲及脊髓圓錐以下的神經(jīng)根構(gòu)成了馬尾神經(jīng)(cauda equina，CE)，其主要功能包括傳導(dǎo)會陰部、馬鞍區(qū)的感覺，控制大小便功能及踝、膝或球海綿體反射，一旦損傷，患者可以出現(xiàn)下腰痛、坐骨神經(jīng)痛以及鞍區(qū)感覺減退或缺失、排便障礙及性功能障礙等為主要表現(xiàn)的臨床癥候群。Mixter等在1934年首次報(bào)道，并將其命名為馬尾神經(jīng)綜合征(cauda equina syndrome，CES)。大部分腰椎退變、腰椎管狹窄、腰椎間盤突出患者都可以先嘗試保

2、守治療，如果癥狀未見緩解或繼續(xù)加重而出現(xiàn)不可耐受的根性痛或運(yùn)動、感覺功能障礙后，才會進(jìn)行擇期手術(shù)治療，而且大部分患者術(shù)后恢復(fù)令人滿意。而CES卻不同，一旦發(fā)病，要求進(jìn)行急診手術(shù)，否則一旦出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷，很難完全恢復(fù)。目前馬尾神經(jīng)綜合征的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能是由于神經(jīng)受到機(jī)械性壓迫、炎癥、靜脈充血或缺血等原因?qū)е虏∽?。由于手術(shù)減壓后病人的癥狀改善并不確定，因此進(jìn)一步研究馬尾神經(jīng)損傷的機(jī)制及非手術(shù)治療方法顯得非常必要。
　　

3、 近年來，嗅鞘細(xì)胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）移植被認(rèn)為是治療神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)過程的最有前景的方法之一。嗅鞘細(xì)胞位于嗅覺系統(tǒng)，是一類獨(dú)特的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。它同時(shí)存在于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并兼具雪旺細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)。在生理狀態(tài)下，嗅神經(jīng)因與外界接觸而易受損傷，因此其終身都在進(jìn)行更新，在整個(gè)過程中，嗅鞘細(xì)胞始終包繞著嗅神經(jīng)軸突，形成神經(jīng)束，引從嗅上皮（olfactoryepithelium，OE）新

4、生的軸突長入位于中樞的嗅球(olfactory bulb，OB)。嗅鞘細(xì)胞具有促進(jìn)嗅神經(jīng)軸突生長及再生的能力，同時(shí)也具有引導(dǎo)其生長的能力，這一特征被成功地應(yīng)用于脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)的治療。大量研究表明，移植到中樞神經(jīng)損傷處的嗅鞘細(xì)胞能形成引導(dǎo)神經(jīng)突起生長通道，再生的神經(jīng)軸突可以沿著這一通道向遠(yuǎn)處延伸，使中樞神經(jīng)損傷得以修復(fù)。移植神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的嗅鞘細(xì)胞可明顯促進(jìn)全脊髓橫斷大鼠皮質(zhì)脊髓束再生。但目

5、前未見移植嗅鞘細(xì)胞治療馬尾神經(jīng)損傷的相關(guān)報(bào)道。
　　 早期的研究表明馬尾神經(jīng)損害導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)內(nèi)神經(jīng)元壞死和脊髓后角細(xì)胞壞死，采用腦源性神經(jīng)生長因子(Basic fibroblast growthfactor，BDNF)能夠促進(jìn)輕、中度損害的馬尾神經(jīng)功能恢復(fù)，但對于重度損傷的情況效果不理想。嗅鞘細(xì)胞的移植是否能夠促進(jìn)馬尾神經(jīng)功能恢復(fù)，是否對不同程度損害的馬尾神經(jīng)功能恢復(fù)都有改善

6、作用以及嗅鞘細(xì)胞移植入體內(nèi)后是否能達(dá)到功能性整合，使損傷的神經(jīng)結(jié)構(gòu)重建，實(shí)現(xiàn)損傷髓鞘的髓鞘化，有待于進(jìn)一步研究。
　　 研究目的:
　　 通過硅膠條壓迫法建立大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。通過顯微注射的細(xì)胞移植方法向硬膜囊內(nèi)注射OECs，將其移植到壓迫損傷部位的馬尾神經(jīng)表面，明確OECs移植后在局部的存活時(shí)間及大鼠馬尾神經(jīng)MBP表達(dá)量及神經(jīng)功能改變情況。
　　 研究方法:
　　 一、采用硅膠條壓迫法成功構(gòu)建椎

7、管狹窄的大鼠馬尾神經(jīng)壓迫模型。將SD大鼠的腰4節(jié)段咬除椎板上緣，暴露硬膜囊，將10mm×0.8mm×1.0mm的硅膠條置入大鼠L4和L5椎管內(nèi)，壓迫7天，通過BBB評分、甩尾痛覺檢測實(shí)驗(yàn)，以及免疫組化染色對損傷情況評估。
　　 二、原代OECs的培養(yǎng)。取SD大鼠OB嗅神經(jīng)層OECs進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，通過差速貼壁及Thy1.1抗體進(jìn)行細(xì)胞純化，通過OECs特異性標(biāo)記物p75NTR及S100的抗體標(biāo)記體外培養(yǎng)的原代OECs，鑒定細(xì)胞

8、純度。
　　 三、OECs移植。取GFP轉(zhuǎn)基因大鼠OB進(jìn)行OECs培養(yǎng)及純化。取符合條件的SD大鼠造模，篩選造模成功的大鼠，進(jìn)行手術(shù)減壓去除壓迫硅膠條后硬膜囊內(nèi)注射8μl GFP-OECs PBS懸液（濃度約1×105/μl），對照組則注射等量的PBS溶液。
　　 四、GFP-OECs移植后在不同時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞移植部位CE制成細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，觀察樣本GFP熒光強(qiáng)度。
　　 五、細(xì)胞移植后在不同時(shí)間點(diǎn)提取各

9、組壓迫損傷部位的馬尾神經(jīng)組織總蛋白，通過Western blot觀察MBP表達(dá)水平的變化。
　　 六、細(xì)胞移植后在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行BBB評分和甩尾實(shí)驗(yàn)觀察手術(shù)減壓及細(xì)胞移植后馬尾神經(jīng)壓迫損傷大鼠的功能變化。
　　 結(jié)果:
　　 一、硅膠條壓迫大鼠馬尾神經(jīng)7天后，大鼠BBB評分逐漸穩(wěn)定在11分左右，甩尾潛伏期由損傷前的4-6s逐漸延長至12s左右，MBP免疫組化顯示大鼠馬尾神經(jīng)出現(xiàn)脫髓鞘表現(xiàn)。通過硅膠條壓迫法可以構(gòu)建

10、穩(wěn)定的大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。
　　 二、所培養(yǎng)的原代OECs純度達(dá)到95％以上，該純度能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。
　　 三、OECs移植后2周時(shí)，樣本的GFP熒光強(qiáng)度高于野生型SD大鼠CE細(xì)胞懸液，2周后損傷局部組織的細(xì)胞懸液GFP熒光與非轉(zhuǎn)基因大鼠的本底熒光強(qiáng)度無明顯差異，說明外源性O(shè)ECs可在損傷局部存活約2周時(shí)間。
　　 四、OECs移植后MBP的表達(dá)水平在移植后的1天、3天沒有顯著變化，而在移植后的2-3

11、周MBP蛋白表達(dá)水平與對照組相比有提高，4周后蛋白表達(dá)水平趨于穩(wěn)定，提示OECs移植有助于成年大鼠馬尾神經(jīng)損傷后的再髓鞘化。
　　 五、OECs移植后BBB評分結(jié)果和甩尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有大鼠在減壓、硬膜囊內(nèi)注射術(shù)后后肢功能逐漸得到一定程度的改善，但是細(xì)胞移植組功能恢復(fù)并未優(yōu)于假移植組，提示這些功能恢復(fù)是由于手術(shù)解除馬尾神經(jīng)壓迫后大鼠自身恢復(fù)所致。
　　 結(jié)論:
　　 OB-OECs可以通過硬膜囊內(nèi)注射的方法進(jìn)行

12、移植，并可在損傷局部聚集至少2周的時(shí)間。移植組動物的MBP表達(dá)量在2-3周時(shí)高于對照組，說明，OECs移植后可能通過細(xì)胞間的相互作用，如分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、激活SCs、清除壞死組織等作用而保護(hù)脫髓鞘的馬尾神經(jīng)，使其在后續(xù)的再髓鞘化過程中更快的恢復(fù)。但是硬膜囊內(nèi)直接注射OECs在4周的時(shí)間內(nèi)并未使實(shí)驗(yàn)動物獲得明顯的功能改善。因此，在OECs移植的具體方法，如注射的細(xì)胞量、細(xì)胞懸液的介質(zhì)等方面仍需進(jìn)一步研究，從而使OECs在馬尾神經(jīng)損傷修復(fù)中