壯肝逐瘀煎對(duì)肝纖維化大鼠肝組織及肝狀細(xì)胞Akt、XIAP因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的:本課題旨在從在體和離體兩方面觀察研究壯肝逐瘀煎對(duì)肝纖維化（Hepatic Fibrosis，HF）大鼠肝組織及肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate Cell，HSC)Akt、XIAP因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡釋壯肝逐瘀煎抗肝纖維化的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:(1)在體實(shí)驗(yàn):選用102只體重約220～250g的健康清潔級(jí)SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠，雌雄各半，為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨

2、機(jī)選取14只作為正常對(duì)照組（A組）。剩余大鼠采用CCL4復(fù)合因素大鼠肝纖維化模型造模方法，進(jìn)行肝纖維化造模。在第4周末A組及造模組大鼠隨機(jī)各處死4只，進(jìn)行病理檢測(cè)，顯示有肝組織纖維化形成，證實(shí)造模成功。然后剩余造模大鼠則隨機(jī)分為:病理模型組（B組）、壯肝逐瘀煎大、中、小劑量（C組、D組、E組）治療組、大黃蟅蟲丸及秋水仙堿（F組、G組）對(duì)照組，每組分為14只大鼠，共六個(gè)組。造模4周后，給予壯肝逐瘀煎大、中、小劑量、大黃蟅蟲丸及秋水仙堿組灌

3、胃給藥和正常組和模型組生理鹽水，灌胃液體用量標(biāo)準(zhǔn)為1ml/100g，1次/天，按體表面積折算藥物濃度和等效劑量。7組大鼠用不同劑量藥物治療6周后，禁食12小時(shí)，每組取10只大鼠，經(jīng)10％水合氯醛麻醉后，再通過(guò)股靜脈采血后處死，立即剖取肝臟，取肝臟右葉大致相同部位組織兩塊，一塊置入10％甲醛中，留作常規(guī)石蠟切片，另一塊于液氮中保存以備提取RNA，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)及組織學(xué)檢測(cè)。(2)離體實(shí)驗(yàn):選用300-350g體重的清潔級(jí)SD大鼠20只

4、，隨機(jī)分為生理鹽水組、壯肝逐瘀煎大劑量組、壯肝逐瘀煎中劑量組、壯肝逐瘀煎小劑量組及秋水仙堿組。按不同藥液灌喂1周后，取各組動(dòng)物血清冷藏備用。取出凍存的HSC-T6細(xì)胞株，將HSC-T6細(xì)胞株放在37℃C、5％CO2混合氣體的孵箱中，用含青霉素(100U/ml)、胎牛血清(10％)和鏈霉素(100U/ml)的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)和傳代。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)達(dá)到良好后，將所有細(xì)胞用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。取出之前培養(yǎng)的細(xì)胞，棄掉里面的培養(yǎng)液

5、，加入適量相應(yīng)制備好的動(dòng)物血清培養(yǎng)基（生理鹽水血清組、秋水仙堿藥物血清組及壯肝逐瘀煎大、中、小劑量藥物血清組）。置入37℃C、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。再取出每組1瓶動(dòng)物血清干預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，向上述培養(yǎng)瓶中加入0.4m10.25％胰酶進(jìn)行消化，離心，低溫保存，培養(yǎng)48小時(shí)，對(duì)比48小時(shí)和24小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)差別。
　　本實(shí)驗(yàn)用肉眼觀察大鼠的主要癥狀和體征;觀察肝組織的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)法(reverse t

6、ralscriptase polymerasechain reaction，RT-PCR)檢測(cè)肝組織和肝星狀細(xì)胞Al、XIAP基因表達(dá)水平;用western blot法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞Akt蛋白的表達(dá)水平;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般體征觀察:壯肝逐瘀煎組，尤其是大劑量組可明顯改善肝纖維化模型組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)量、飲食和皮毛色澤，其體重也有所增長(zhǎng)。(2)肝纖維化大鼠肝臟組織大體形態(tài)的觀

7、察:壯肝逐瘀煎各組治療后肝臟組織形態(tài)較模型對(duì)照組改善較為明顯，大、中劑量組尤為顯著。(3) RT-PCR檢測(cè)大鼠肝組織中Akt、XIAPmRNA表達(dá)情況:①壯肝逐瘀煎對(duì)肝纖維化大鼠肝組織AktmRNA表達(dá)的影響:結(jié)果顯示壯肝逐瘀煎治療組、大黃蟅蟲丸組及秋水仙堿組均能降低AktmRNA的表達(dá)（P＜0.05）;壯肝逐瘀煎大劑量組效果最好(P＜0.01)，壯肝逐瘀煎中劑量組次之;壯肝逐瘀煎小劑量組和秋水仙堿組效果相當(dāng)。②壯肝逐瘀煎對(duì)肝纖維化大

8、鼠肝組織XIAPmRNA表達(dá)的影響:結(jié)果顯示壯肝逐瘀煎大劑量組能明顯降低XIAPmRNA的表達(dá)(P＜0.01);壯肝逐瘀煎中劑量組和大黃蟅蟲丸組也能降低XIAPmRNA的表達(dá)(P＜0.05);壯肝逐瘀煎小劑量組和秋水仙堿組效果相當(dāng)。(4) RT-PCR檢測(cè)大鼠肝星狀細(xì)胞Akt、XIAPmRNA表達(dá)的情況:隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，壯肝逐瘀煎各治療組及秋水仙堿組均能降低大鼠肝星狀細(xì)胞Akt、XIAPmRNA的表達(dá)（P＜0.05），其中以壯肝逐瘀

9、煎大劑量組最為顯著（P＜0.01）;實(shí)驗(yàn)48h壯肝逐瘀煎大劑量組肝星狀細(xì)胞Akt、XIAPmRNA的表達(dá)較實(shí)驗(yàn)24h壯肝逐瘀煎大劑量組明顯降低（P＜0.01）。(5)用western blot法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)情況:結(jié)果顯示，壯肝逐瘀煎各治療組、秋水仙堿組均能下調(diào)大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白的比值水平（P＜0.05），其中以壯肝逐瘀煎大劑量組的下調(diào)最為顯著（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)48h壯肝逐瘀煎大劑量組肝星狀細(xì)胞Akt蛋白的表達(dá)